3. đỐI TƯỢN G NỘI DUN G PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp lấy mẫu
3.5.1.1. Phương pháp lấy mẫu phân
Chúng tôi trực tiếp xuống các hộ gia ựình trong ựịa bàn nghiên cứu thu thập mẫu phân, lấy 30 - 40gr phân/con chó; 5 - 10gr phân/con mèo. Mẫu lấy ựược ựảm bảo tắnh ngẫu nhiên. Mẫu sau khi ựược lấy cho vào lọ có ghi mã số rõ ràng, ựầy ựủ thông tin về lứa tuổi, tắnh biệt, giống chó (mèo), số thứ tự, ựịa ựiểm lấy mẫu, phương thức chăn nuôi, có hay ăn cá sống hay không. Các thông tin phải ựược ghi chép cẩn thận theo quy ựịnh từ trước, tránh tình trạng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 29
nhầm lẫn mẫu hay bất cứ thông tin gì có liên quan ựể dễ dàng cho công tác theo dõi, ựiều trị thử.
Mẫu sau khi ựược thu thập, ựánh mã số ựược kiểm tra ngay tại chỗ hoặc ựưa về bộ môn kiểm tra, xét nghiệm.
3.5.1.2. Phương pháp xét nghiệm phân tìm trứng
Khi lấy ựược mẫu phân chúng tôi tiến hành xét nghiệm phân theo phương pháp gạn rửa xa lắng ựể tìm trứng.
- Nguyên lý: Lợi dụng sự chênh lệch tỷ trọng của trứng sán với nước sạch ựể phân ly trứng ra khỏi dung dịch phân. Trứng sán lá có trọng lượng riêng lớn hơn nước nên chìm xuống dưới.
- Tiến hành: Lấy 5-10 gram phân của gia súc cần chẩn ựoán cho vào cốc sạch. đổ vào cốc một ắt nước sạch dùng ựũa thủy tinh khuấy nát phân sau ựó thêm nước ( lượng nước gấp khoảng 10 lần lượng phân ). Lọc dung dịch qua lưới sắt vào cốc sạch to hơn, cặn bỏ ựi. đổ thêm nước sạch cho ựầy cốc, khuấy ựều, ựể yên tĩnh khoảng 4-5 phút, cẩn thận lọc lấy cặn gạn bỏ phần nước trong ở trên ựi, cứ làm như thế cho ựến khi nước phắa trên trong và cặn ở ựáy cốc còn ắt, thì gạn bỏ phần nước trong phắa trên ựi lấy cặn ựáy cho vào ựĩa petri hoặc ựĩa kắnh ựồng hồ, quan sát dưới kắnh lúp hoặc dưới kắnh hiển vi ựể tìm trứng sán [16].
3.5.1.3. Phương pháp ựếm trứng Mc. Master
Cho 3 gam phân vào bình thủy tinh, hoặc lọ nhựa. Cho nước muối bão hòa ựến vạch 45ml, dùng ựũa thủy tinh hay viên bi trộn ựều lọc qua lưới lọc
có kắch cỡ 16- 36 lỗ/cm2. Cho thêm nước muối bão hòa ựến vạch 45 ml, trộn
ựều và hút dung dịch cho lên 2 buồng ựếm của Slide. ựể yên từ 2-5 phút sau ựó ựưa soi dưới kắnh hiển vi ựếm số trứng trên hai buồng ựếm.
Cách tắnh số trứng trong 1 gam phân:
- Thể tắch của buồng ựếm là 0,15 ml. Ta có 0,15 ml của 3 gam phân trong dung dịch 45 ml.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 30 - Gọi số trứng ựếm ựược là X X ừ 45 - Ta có số trứng trong 45 ml là: 0,15 X ừ 45
- Số trứng có trong 1 gam phân là:
0,15 x 3
Phương pháp này cho phép ựịnh lượng chắnh xác số lượng trứng có trong 1 gam phân, nó cho phép ựánh giá mức ựộ cảm nhiễm của sán. Dùng phương pháp này ựể ựánh giá hiệu quả của thuốc tẩy sán [16].
3.5.1.4. Phương pháp ựịnh loại trứng sán lá gan nhỏ
định loại trứng sán lá gan nhỏ theo khoá ựịnh loại của Mỏnnig (Trịnh Văn Thịnh), 1963 [26].
Ảnh 4. Trứng sán lá gan nhỏ
3.5.1.5. Phương pháp lấy mẫu bệnh phẩm
Chúng tôi tiến hành mổ khám phi toàn diện ựường tiêu hoá của chó, mèo ựể lấy bệnh phẩm là túi mật, gan và tuỵ ựược tách riêng từng lọ sau ựó kiểm tra [16].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 31
-Túi mật, ống dẫn mật: Lấy chất chứa bên trong sau ựó dùng phương
pháp gan rửa sa lắng, lấy cặn soi kắnh hiển vi tìm sán.
-Gan, tuỵ: cắt nhỏ ngâm trong dung dịch muối khoảng 10 phút, sau ựó
bóp nát, lọc qua rây lọc kắch thước lớn ựến khi nước trong, gạn nước trong ựi lấy cặn soi kắnh hiển vi tìm sán.
Khi phát hiện sán, dùng kim hoặc panh kẹp lấy sán ra bảo quản trong lọ chứa Formalin. Các lọ chứa sán cũng ựược ựánh mã số sao cho phù hợp với các mẫu bệnh phẩm.
3.5.1.6. Phương pháp làm tiêu bản cố ựịnh
Sau khi thu thập ựược mẫu sán chúng tôi tiến hành phương pháp nhuộm Carmin ựể ựịnh loại sán.
- Chuẩn bị dung dịch thuốc nhuộm carmine-axitclohidric (HCL): Lấy 5
gam Carmine nghiền nhỏ cho vào bình tam giác chứa 5ml dung dịch HCL và
5ml nước cất, ựể yên sau 1 giờ, sau ựó cho thêm 200ml cồn 900, lắc ựều, ựậy
nút bông, ựun cách thuỷ cho tới khi Carmine tan hết, ựể 1 ngày sau ựem lọc. Dung dịch ựể sau 1 tuần mới dùng.
- Nhuộm mẫu: Nhuộm mẫu trong carmine-axit, ựể mẫu trong dung dịch nhuộm khoảng 5 - 10 phút. để tẩy bớt Carmine, làm rõ cấu tạo chi tiết, mẫu
phải chuyển sang cồn-axit (100ml cồn 800, thêm vào 2-3 giọt HCL) với thời
gian 1 - 2 phút. Sau ựó rút nước trong cồn ở các nồng ựộ khác nhau: 800, 900,
1000, thời gian trong mỗi loại cồn từ 5 - 7 phút. Sau ựó làm trong mẫu bằng
dung dịch Xylen + cồn 1000 theo tỷ lệ 1:1 trong thời gian 1 - 2 phút. Cuối cùng lên tiêu bản bằng cách nhỏ lên lam kắnh sạch 1 - 2 giọt bom Canada, ựặt mẫu vào cho ngay ngắn, nhỏ tiếp 1 giọt bom lên trên rồi ựậy lamen lại. để tiêu bản ở vị trắ nằm cho tới khi bom khô thì tiêu bản ựã hoàn toàn ựảm bảo.
3.5.1.7. Phương pháp ựịnh loại sán lá gan nhỏ
đo, vẽ sán lá gan dưới kắnh hiển vi thông thường, ựịnh loại sán theo hình thái dựa vào tài liệu của Phan Thế Việt, Nguyễn Thị Kỳ, Nguyễn Thị Lê; 1977 [29].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 32