3. ðỐ IT ƯỢNG, ðỊ Að IỂM, NỘI DUNG, NGUYấN LIỆU
3.4.2Xỏc ủị nh liều sử dụng vacxin giải ủộ c tố E.coli thớch hợp
Liều sử dụng vacxin giải ủộc tố E. coli ủược xỏc ủịnh thụng qua cỏc liều thử khỏc nhau trờn bản ủộng vật là lợn con sau cai sữa và lợn nỏi chửa.
3.4.2.1 Bố trớ thớ nghiệm ủối với lợn con sau cai sữa
ðối tượng thử nghiệm là lợn con sau cai sữa khỏe mạnh (từ 21 - 30 ngày tuổi), trọng lượng 5 - 7 kg. Tổng số lợn thử nghiệm là 50 con, chia làm 2 nhúm: Nhúm thớ nghiệm và nhúm ủối chứng.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 39
Nhúm thớ nghiệm: Gồm 40 con chia làm 4 lụ: 1, 2, 3, 4; mỗi lụ 10 con và tiến hành tiờm vacxin giải ủộc tố E. coli vào dưới da bẹn với liều:
+ Lợn lụ thớ nghiệm 1: 0,5 ml/con + Lợn lụ thớ nghiệm 2: 1 ml/con + Lợn lụ thớ nghiệm 3: 2 ml/con + Lợn lụ thớ nghiệm 4: 3 ml/con
Nhúm ủối chứng: Gồm 10 con, khụng tiờm.
Trước khi tiờm vacxin, tiến hành lấy mỏu, chắt huyết thanh kiểm tra hiệu giỏ khỏng ủộc tố E. coli bằng phản ứng kết tủa nhanh trờn phiến kớnh với khỏng nguyờn giải ủộc tố E. coli (theo phương phỏp thường quy).
Sau khi tiờm vacxin, theo dừi 7 ngày liờn tục cỏc biểu hiện khỏc thường của lợn. 21 ngày sau tiờm, tiến hành lấy mỏu vịnh mạch cổ, ly tõm thu huyết thanh và kiểm tra hiệu giỏ khỏng ủộc tố E. coli bằng phản ứng kết tủa nhanh trờn phiến kớnh với giải ủộc tố E. coli . Từủú xỏc ủịnh ủược liều sử dụng thớch hợp cho lợn con sau cai sữa.
Thớ nghiệm ủược bố trớ theo bảng sau:
Chỉ tiờu Lụ Số lợn (con) Liều vacxin tiờm (ml/con) ðường tiờm
Thời gian theo dừi (ngày) 01 10 0,5 DD 21 02 10 1 DD 21 03 10 2 DD 21 Thớ nghiệm 04 10 3 DD 21 ðối chứng 10 Khụng tiờm 21 3.4.2.2 Bố trớ thớ nghiệm ủối với lợn nỏi chửa
ðối tượng thử nghiệm là lợn nỏi chửa, khỏe mạnh, cú thời gian mang thai từ 2 - 2,5 thỏng. Tổng số lợn thử nghiệm là 25 con, chia làm 2 nhúm: Nhúm thớ nghiệm và nhúm ủối chứng.
Nhúm thớ nghiệm: Gồm 20 con, ủược chia làm 4 lụ: 1, 2, 3, 4; mỗi lụ 5 con và tiến hành tiờm vacxin giải ủộc tố E. coli cho lợn 2 lần vào dưới da, lần 1 trước khi ủẻ từ 35 - 45 ngày (5 - 6 tuần), lần 2 sau lần 1 từ 14 - 21 ngày ( 2 - 3 tuần) với liều như sau:
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 40 + Lợn lụ thớ nghiệm 1: 1 ml/con + Lợn lụ thớ nghiệm 2: 2 ml/con + Lợn lụ thớ nghiệm 3: 3 ml/con + Lợn lụ thớ nghiệm 4: 4 ml/con Nhúm ủối chứng: Gồm 5 con, khụng tiờm.
Trước khi tiờm vacxin, tiến hành lấy mỏu kiểm tra hiệu giỏ khỏng ủộc tố E.
coli bằng phản ứng kết tủa nhanh trờn phiến kớnh với giải ủộc tố E. coli (theo
phương phỏp thường quy).
Sau khi tiờm vacxin, theo dừi 7 ngày liờn tục cỏc biểu hiện khỏc thường của lợn. 21 ngày sau khi tiờm mũi 2 hoặc khi lợn ủẻ, tiến hành lấy mỏu tĩnh mạch tai tất cả lợn ở cỏc lụ, ly tõm thu huyết thanh và kiểm tra hiệu giỏ khỏng ủộc tố E. coli.
Thớ nghiệm ủược bố trớ theo bảng sau:
Liều vacxin tiờm (ml/con) Chỉ tiờu Lụ Số lợn (con) Lần 1 (trước ủẻ 35-45 ngày) Lần 2 (sau lần 1:14-21 ngày) ðường tiờm 01 5 1 1 DD 02 5 2 2 DD 03 5 3 3 DD TN 04 5 4 4 DD ðối chứng 5 Khụng tiờm
Kiểm tra hiệu giỏ khỏng ủộc tố E. coli bằng phản ứng kết tủa nhanh trờn phiến kớnh với giải ủộc tố E. coli. Từủú xỏc ủịnh ủược liều sử dụng thớch hợp cho lợn nỏi chửa.
3.4.3 Xỏc ủịnh chỉ tiờu an toàn của vacxin giải ủộc tố E. coli
3.4.3.1 Xỏc ủịnh chỉ tiờu an toàn của vacxin ủối với ủộng vật thớ nghiệm.
ðối tượng thớ nghiệm là chuột bạch khỏe mạnh, cú trọng lượng 18 - 20 gram. Chọn 50 con chuột bạch, chia làm 2 nhúm: Nhúm thớ nghiệm và nhúm ủối chứng.
Nhúm thớ nghiệm: Gồm 40 con, chia làm 4 lụ: 1, 2, 3, 4; mỗi lụ 10 con. Tiến hành tiờm vacxin giải ủộc tố E. coli vào dưới da lưng cho chuột thớ nghiệm ở cỏc lụ
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 41
với liều như sau:
+ Chuột lụ thớ nghiệm 1: 0,2 ml/con + Chuột lụ thớ nghiệm 2: 0,4 ml/con + Chuột lụ thớ nghiệm 3: 0,8 ml/con + Chuột lụ thớ nghiệm 4: 1 ml/con
Nhúm ủối chứng: Gồm 10 con, khụng tiờm. Thớ nghiệm ủược bố trớ theo bảng sau:
Chỉ tiờu Lụ Số chuột (con) ðường tiờm Liều vacxin tiờm (ml/con) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thời gian theo dừi (ngày) 01 10 DD 0,2 7 02 10 DD 0,4 7 03 10 DD 0,8 7 Thớ nghiệm 04 10 DD 1 7 ðối chứng 10 Khụng tiờm 7
Sau khi tiờm theo dừi cỏc biểu hiện khỏc thường, cỏc phản ứng cục bộ, phản ứng toàn thõn và khả năng gõy chết chuột (nếu cú) 7 ngày liờn tục.
3.4.3.2 Xỏc ủịnh chỉ tiờu an toàn của vacxin ủối với bản ủộng vật
Sau khi xỏc ủịnh ủược liều sử dụng của vacxin cho lợn, ủó tiến hành xỏc ủịnh chỉ tiờu an toàn của vacxin ủối với bản ủộng vật là lợn con sau cai sữa và lợn nỏi chửa (theo 10TCN 703-2006 “Quy trỡnh kiểm nghiệm vacxin E. coli vụ hoạt”) [40].
a. Bố trớ thớ nghiệm ủối với lợn con sau cai sữa
ðối tượng thớ nghiệm là lợn con sau cai sữa khỏe mạnh, tuổi từ 21 - 30 ngày, cựng giống, cú trọng lượng 5 - 7 kg, ủược nuụi trong ủiều kiện chăm súc như nhau. Chọn 90 con, chia làm 2 nhúm: Nhúm thớ nghiệm và nhúm ủối chứng.
Nhúm thớ nghiệm: Gồm 80 con, ủược chia làm 8 lụ; mỗi lụ10 con, tiờm dưới da bẹn với liều gấp ủụi liều sử dụng.
Nhúm ủối chứng: Gồm 10 con, khụng tiờm.
Theo dừi chỉ tiờu an toàn của vacxin trong thời gian 7 ngày liờn tục sau tiờm ủối với lợn con thớ nghiệm thụng qua cỏc biểu hiện khỏc thường, cỏc phản ứng cục bộ (nếu cú), tăng trọng của lợn sau 1 thỏng thớ nghiệm.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 42
Thớ nghiệm ủược bố trớ theo bảng sau:
Chỉ tiờu Lụ
Số lợn
(con) tiờm (ml/con) Liều vacxin ðườtiờm ng Stiờm ố lần
Thời gian theo dừi (ngày) Ghi chỳ 01 10 4* DD 1 7 02 10 4 DD 1 7 03 10 4 DD 1 7 04 10 4 DD 1 7 05 10 4 DD 1 7 06 10 4 DD 1 7 07 10 4 DD 1 7 Thớ nghiệm 08 10 4 DD 1 7 Liều tiờm 4 ml/con là liều gấp ủụi liều sử dụng của vacxin ðối chứng 10 Khụng tiờm 7 b. Bố trớ thớ nghiệm ủối với lợn nỏi chửa
ðối tượng thớ nghiệm là lợn nỏi chửa, khỏe mạnh, cú thời gian mang thai từ 2 - 2,5 thỏng. Chọn 45 con, chia làm 2 nhúm: Nhúm thớ nghiệm và nhúm ủối chứng.
Nhúm thớ nghiệm: Gồm 40 con, ủược chia làm 8 lụ, mỗi lụ vacxin 5 con. Lợn ủược tiờm dưới da trước khi ủẻ từ 35 - 45 ngày (5 - 6 tuần) với liều gấp ủụi liều sử dụng.
Nhúm ủối chứng: Gồm 5 con, khụng tiờm. Thớ nghiệm ủược bố trớ theo bảng sau:
Chỉ tiờu Lụ Số lợn (con) Liều vacxin tiờm (ml/con) ðường tiờm Số lần tiờm Thời gian theo dừi (ngày) Ghi chỳ 01 5 6* DD 1 7 02 5 6 DD 1 7 03 5 6 DD 1 7 04 5 6 DD 1 7 05 5 6 DD 1 7 06 5 6 DD 1 7 07 5 6 DD 1 7 Thớ nghiệm 08 5 6 DD 1 7 Liều tiờm 6 ml/con là liều gấp ủụi liều sử dụng của vacxin ðối chứng 5 Khụng tiờm 7
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 43 1 2 3 6 5 4
Theo dừi cỏc ủối tượng thớ nghiệm và ủỏnh giỏ kết quả dựa trờn cỏc biểu hiện khỏc thường, cỏc phản ứng cục bộ (nếu cú), hiện tượng sảy thai... Theo dừi lợn thớ nghiệm sau tiờm 7 ngày liờn tục.
3.4.4 Nghiờn cứu xỏc ủịnh hiệu lực của vacxin giải ủộc tố E. coli
3.4.4.1 Phương phỏp xỏc ủịnh hàm lượng giải ủộc tố cú trong vacxin bằng phản
ứng ADP (Agar-gel Diffuse Precipitation) a. Chuẩn bị nguyờn liệu
* Chuẩn bịủĩa thạch làm phản ứng:
Purified agar dựng cho ADP (Oxoid) 1 g
NaCl 8 g
Phenol 0.5 ml
Nước cất 100 ml
ðun cho thạch tan, chỉnh pH ủến 7.5 bằng dung dịch NaOH 0,1N. Hấp tiệt trựng rồi ủổ thạch núng chảy ủang ở 50°C vào ủĩa petri ủường kớnh 10cm vụ trựng, sao cho ủộ dày của lớp thạch khoảng 3 - 5 mm. ðể thạch ủụng ủặc ở nhiệt ủộ phũng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ðục lỗ thạch, 1 lỗ trung tõm và 6 lỗ xung quanh (hỡnh vẽ). Mỗi lỗ cú ủường kớnh 6mm. Khoảng cỏch từ lỗ trung tõm ủến cỏc lỗ xung quanh là 3 - 4 mm. Sau khi ủục xong dựng kim lấy miếng thạch vừa ủục ra, ủể tạo lỗ thạch làm khuụn cho phản ứng. Sau ủú nhỏ vào mỗi lỗ một giọt thạch núng chảy trỏng kớn ủỏy lỗủể phản ứng ADP xảy ra trong thạch.
* Chuẩn bị mẫu:
Mẫu vacxin kiểm nghiệm ủược ủể lắng 3 ngày ở 5 - 10°C, hoặc ly tõm 2000 vũng/phỳt trong 10 phỳt, thu lấy phần nước trong.
Phần nước trong ủem pha loóng trong dóy 6 ống nghiệm theo cấp số 2 (như thường quy), ta cú ủộ pha loóng của vacxin trong cỏc ống nghiệm từ ống số 1 ủến
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 44
ống số 6 lần lượt là: mẫu nguyờn (N), 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 ủể làm phản ứng.
* Chuẩn bị khỏng ủộc tố: Khỏng ủộc tố dựng cho ADP là huyết thanh của chuột bạch ủó ủược miễn dịch cao ủộ bằng vacxin giải ủộc tố E. coli .
* Chuẩn bị ủối chứng õm: ðối chứng õm là mụi trường nước thịt dinh dưỡng vụ trựng cho thờm 0,5% phenol hoặc nước sinh lý vụ trựng cú 0,5% phenol.
b. Tiến hành phản ứng
Nhỏ vào lỗ trung tõm khỏng ủộc tố chuẩn.
Cỏc lỗ xung quanh ủược ủỏnh số, lần lượt từ 1 - 6, nhỏ mẫu vacxin kiểm nghiệm ủó chuẩn bị: + Lỗ 1: Nhỏ mẫu nguyờn (khụng pha loóng)
+ Lỗ 2: Nhỏ mẫu pha 1/2 + Lỗ 3: Nhỏ mẫu pha 1/4 + Lỗ 4: Nhỏ mẫu pha 1/8 + Lỗ 5: Nhỏ mẫu pha 1/16 + Lỗ 6: Nhỏ dịch ủối chứng ðĩa thạch phản ứng ủược ủể trong hộp ẩm và ủặt ở 37°C. c. ðọc kết quả
Dựng ủốn sỏng chiếu xiờn, ngược từủỏy ủĩa thạch; phỏt hiện vạch kết tủa màu trắng ủục ở phần thạch giữa lỗ trung tõm và cỏc lỗ xung quanh.
Theo dừi phản ứng sau 48, 72 hoặc 96 giờ: ðộ pha loóng cuối cựng cũn xuất hiện vạch kết tủa ủược coi là hiệu giỏ giải ủộc tố của mẫu vacxin cần kiểm tra.
3.4.4.2 Phương phỏp xỏc ủịnh hiệu lực của vacxin giải ủộc tố E. coli ủối với ủộng vật thớ nghiệm (phương phỏp trực tiếp)
a. Phương phỏp kiểm tra tớnh sinh miễn dịch của vacxin ủối với chuột bạch
Chọn 15 con chuột bạch 18 - 20 gram, chia làm hai lụ thớ nghiệm: + Lụ 1 (5 con): Khụng tiờm ủể làm ủối chứng
+ Lụ 2 (10 con): Tiờm lần 1 mỗi con 0,4 ml vacxin vào dưới da lưng. 7 ngày sau tiờm lần 2, vào phỳc xoang, mỗi con 0,4 ml nước trong của vacxin kiểm nghiệm (ủể lắng 3 ngày ở 5 - 10°C hoặc ly tõm 2000 vũng/phỳt trong 10 phỳt).
21 ngày sau khi tiờm lần 2, lấy mỏu tim của tất cả chuột ủó miễn dịch và chuột ủối chứng, chắt lấy huyết thanh riờng từng chuột.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 45
kớnh và phản ứng kết tủa chậm trong ống nghiệm (phản ứng lờn bụng) với khỏng nguyờn giải ủộc tố (theo thường quy) ủể xỏc ủịnh hiệu giỏ khỏng ủộc tố (khỏng thể) E. coli.
* Phương phỏp tiến hành phản ứng kết tủa giữa giải ủộc tố với huyết thanh của chuột miễn dịch:
Huyết thanh ủược ly tõm (tối thiểu 4500 vũng/phỳt trong 10 phỳt) loại hết cặn. Huyết thanh ủược pha loóng bậc 2 như thường quy, bổ sung khỏng nguyờn giải ủộc tố vào huyết thanh ủó pha loóng theo tỷ lệ thể tớch 1:1. Theo dừi liờn tục phản ứng trong thời gian 3 ngày, hiệu giỏ ủược xỏc ủịnh là ủộ pha loóng huyết thanh cao nhất mà vẫn thấy kết tủa. ðỏnh giỏ kết quả:
+ Tớnh hiệu giỏ khỏng ủộc tố trung bỡnh của huyết thanh chuột lụ 1. + Tớnh hiệu giỏ khỏng ủộc tố trung bỡnh của huyết thanh chuột lụ 2.
+ So sỏnh 2 giỏ trị trung bỡnh ủểủỏnh giỏ tớnh sinh miễn dịch của vacxin giải ủộc tố.
b. Phương phỏp kiểm tra hiệu lực của vacxin ủối với chuột bạch
- Xỏc ủịnh liều tối thiểu gõy chết 100% chuột (Minimum Lethal Dose = MLD) của dịch lọc canh trựng và hỗn hợp canh trựng vi khuẩn E. coli cường ủộc
Dựa trờn những kết quả ủó nghiờn cứu về ủộc tố và khả năng gõy bệnh của từng chủng E. coli cường ủộc khi mới phõn lập ủược ở giai ủoạn ủầu của ủề tài “Nghiờn cứu ủộc tố vi khuẩn E. coli, chế thuốc phũng bệnh tiờu chảy và sưng phự ủầu ở lợn”. ðể khẳng ủịnh dựng dịch lọc canh trựng hay canh trựng nguyờn sau khi nuụi cấy cỏc chủng E. coli cường ủộc, ủể cụng cường ủộc sau khi gõy miễn dịch bằng vacxin giải ủộc tố E. coli, chỳng tụi ủó tiến hành:
Nuụi cấy riờng từng chủng E. coli cường ủộc trong mụi trường nước thịt bằng phương phỏp nuụi cấy ủộng, trong thời gian 3 ngày, sau ủú trộn chung với tỷ lệ thể tớch bằng nhau, thu ủược hỗn hợp canh trựng gồm vi khuẩn E. coli và ngoại ủộc tố. Chia ủụi lượng hỗn hợp canh trựng thu ủược, tiến hành:
Một nửa hỗn hợp canh trựng ủem ly tõm (tối thiểu 4500 vũng/phỳt trong 10 phỳt) loại hết cặn (thõn vi khuẩn), lọc qua màng lọc cú ủường kớnh lỗ lọc 0,2 àm, thu phần nước trong (dịch lọc canh trựng chứa ngoại ủộc tố) rồi tiờm với cỏc liều khỏc nhau 0,4 ml/con, 0,6 ml/con, 0,8 ml/con và 1 ml/con chuột, theo cỏc ủường tiờm khỏc nhau (dưới da, phỳc xoang và tĩnh mạch) cho chuột bạch cú trọng lượng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 46
18 - 20 gram. Mỗi ủường tiờm cho 10 con chuột. Theo dừi liờn tục 7 ngày. Xỏc ủịnh ủược liều tối thiểu gõy chết 100% chuột thớ nghiệm.
Chuột ủối chứng ủược tiờm bằng mụi trường nước thịt, liều tiờm tương ứng với liều thớ nghiệm cao nhất 1 ml/con. Mỗi ủường tiờm tiờm cho 10 con chuột.
Một nửa hỗn hợp canh trựng ủem nuụi cấy, xỏc ủịnh số lượng CFU/ml rồi tiờm cỏc liều khỏc nhau (CFU/con), theo ủường tiờm phỳc xoang, cho chuột bạch cú trọng lượng 18 - 20 gram. Mỗi liều tiờm cho 10 con chuột. Theo dừi liờn tục 7 ngày.
Xỏc ủịnh ủược liều tối thiểu gõy chết 100% chuột [33]. - Kiểm tra hiệu lực ủối với chuột bạch
Bố trớ 2 nhúm chuụt thớ nghiệm tương ứng với hai loại khỏng nguyờn: Dịch lọc canh trựng và hỗn hợp canh trựng nguyờn thõn.
Mỗi loại khỏng nguyờn sử dụng 30 con chuột bạch 18 -20g, chia làm 3 lụ thớ nghiệm: + Lụ 1 (10 con): Lụ miễn dịch, tiờm lần 1 mỗi con 0,4 ml vacxin vào dưới da lưng. 7 ngày sau thỡ tiờm lần 2, mỗi con 0,4 ml nước trong của vacxin kiểm nghiệm (ủó ủể lắng 3 ngày ở 5 - 10°C hoặc ly tõm 2000 vũng/phỳt trong 10 phỳt) vào phỳc xoang. + Lụ 2 (10 con): Lụ ủối chứng, chờ tiờm ủối chứng thử thỏch cường ủộc.