4. ðố it ượ ng, ñị añ iểm và thời gian nghiên cứu của ñề tài
1.3.5. Khả năng hình thành một số enzym ngoại bào của chủng nấm
Metarhizium
Kết quả các thắ nghiệm năm 2002 tại Viện Bảo vệ thực vật, cho thấy khả năng hình thành enzym lipaza trên nền cơ chất Tween 80 cho vòng phân giải ựạt cao là 1,3 - 1,75 mm, khả năng phân giải enzym kitinaza trên nền cơ chất là vỏ tôm ựạt 0,96 - 1,3 mm, trên nền vỏ cua ựạt 0,92 - 1,34 mm và khả năng phân giải enzym xenllulaza trên nền cơ chất là giấy và bông ựạt ựược 0,91 - 1,35 mm (Phạm Thị Thùy và Vũ Hải Thùy, 2002). [ ]
Kết quả này ựã mở hướng nghiên cứu về khả năng lây lan của nấm
Metarhizium.
1.3.6. Con ựường truyền bệnh và cơ chế gây bệnh của nấm Metarhizium
Ớ Con ựường truyền bệnh.
Nguyên nhân gây bệnh chủ yếu của nấm lên côn trùng là do quá trình lây lan từ những côn trùng ựã bị nhiễm bệnh sang con khỏe thông qua tiếp xúc trực tiếp với nhau hoặc qua nguồn thức ăn có chứa mầm bệnh. Bệnh vi nấm rất dễ lan truyền bằng va chạm ựơn giản mà hầu như ở vi sinh vật khác hầu như không xảy ra.
Ớ Cơ chế gây bệnh của nấm Metarhizium.
Khi bào tử nấm bám trên bề mặt da côn trùng trong vòng 24 giờ thì bào tử sẽ tạo thành ống mầm xuyên qua da côn trùng, sau ựó tiếp tục phân nhánh tạo nên một mạng sợi nấm chằng chịt bên trong cơ thể côn trùng. Sau ựó nấm tiết ra các ựộc tố Destruxin A, B, E có ựặc tắnh kháng côn trùng. Các ựộc tố này có vai trò quan trọng làm yếu ựi hệ thống phòng thủ miễn dịch của côn trùng ký chủ, phân giải hệ thống vi sợi và vi ống làm cho ký chủ ăn và vận ựộng khó khăn. Côn trùng bị nhiễm nấm khi gặp các ựiều kiện thắch hợp như nhiệt ựộ, ẩm ựộ, quá trình bệnh
lý sẽ làm tăng nhiệt ựộ cơ thể và do vậy làm tăng cường sự phát triển của các vi sinh vật ựang xâm nhiễm. Tiếp sau ựó, bào tử nấm nảy mầm, hệ
sợi phát triển tới mức phủ kắn các lỗ thông hơi trên cơ thể côn trùng. Quá trình sinh trưởng, phát triển của bào tử và hệ sợi nấm ăn sâu vào cơ thể
côn trùng. đây cũng là quá trình các vi nấm hấp thụ chất dinh dưỡng từ
cơ thể côn trùng.
1.3.7. Triệu chứng côn trùng bị bệnh do nấm Metarhizium
Khi bị bệnh nấm, côn trùng ngừng vận ựộng từ 2 - 3 ngày, thậm chắ một tuần trước khi sợi nấm phát triển dầy ựặc trong toàn bộ thân. Côn trùng bị bệnh do nấm Metarhizium thì chúng ngừng di ựộng 24 giờ
trước khi sợi nấm từ trong cơ thể phát triển ra bên ngoài. Chỉ những côn trùng bị thương hay bị bệnh nấm, mầu sắc thân mới bị thay ựổi và xuất hiện những vết ựen. Côn trùng bị bệnh nấm khi chết thường có mầu hồng, vàng nhạt và trắng, thân hơi cứng lại, mầu sắc này phụ thuộc vào mầu sắc của bào tử nấm gây bệnh.
Sự thay ựổi về kắch thước và hình thái cơ thể của côn trùng là ựặc trưng của các bệnh mãn tắnh hoặc các bệnh xâm nhập vào chậm. Trường hợp bị bệnh do nấm, thân cơ thể côn trùng ngắn lại hoặc bị khô ựét ựi là do hệ thống tiêu hóa bị tổn thương hoặc do thiếu thức ăn. Khi côn trùng bị bệnh nấm thì tuyến mỡ và các mô khác bị hòa tan là do lipaza và proteaza của nấm tiết ra nhờ ựặc ựiểm ựó mà người ta có thể xác ựịnh
ựược côn trùng bị bệnh là do ựộng vật nguyên sinh hay do nấm gây ra. Hiện tượng chết hoại gắn liền với hiện tượng tiêu hủy mô là ựặc chưng của bệnh nấm. Quá trình này tiến triển qua hai giai ựoạn:
- Hiện tượng chấn thương: Các mô tổn thương bị phá hoại là do nấm từ bên ngoài gây ra, trong trường hợp này các lympho máu ựọng lại và mô tái sinh ựược tạo nên trên bề mặt phần thân côn trùng bị chấn thương.
- Hiện tượng nhiễm trùng máu của côn trùng khi bị bệnh nấm là do lympho chứa ựầy sợi nấm hoặc những giai ựoạn phát triển khác nhau của nấm. Hiện tượng thực bào là hiện tượng các quá trình bao vây và nuốt một phần tiểu thể nhất ựịnh tạo thành các tế bào khổng lồựược hình thành và ký sinh trên côn trùng làm cho côn trùng chết.
1.4. Những nghiên cứu trong nước
1.4.1. Những nghiên cứu về thành phần sâu hại rau họ hoa thập tự và thiên ựịch của chúng thiên ựịch của chúng
Theo Mai Thị Phương Anh (1996) [1] rau họ hoa thập tự
Cruciferae là loài rau phổ biến nhất thế giới, từ ác vùng nhiệt nóng ẩm
ựến miền Bắc Cực lạnh giá. Trong ựiều kiện thời tiết ở Việt Nam, rau họ
hoa thập tự có thể sinh trưởng phát triển gần như quanh năm trên ựồng ruộng ựặc biệt là các giống rau cải xanh..
Ở Việt Nam những năm gần ựây diện tắch rau họ thập tự ngày càng ựược mở rộng. Kết quả ựiều tra tình hình sản xuất rau vụ xuân hè những năm 1998 Ờ 2001 của Nguyễn Thị Hoa và cộng sự (2001) [9] cho thấy: diện tắch rau xuân hè vùng ngoại thành Hà Nội hang năm từ 3.952 Ờ 4148 ha trong ựó diện tắch rau họ thập tự là 1384 Ờ 1619 ha.
Tuy nhiên sản xuất rau họ hoa thập tự cũng phải ựương ựầu với các khó khăn như các loại cây trồng khác ựó là sâu bệnh hại ựặc biệt là các vùng chuyên canh rau. Theo kết quảựiều tra của Viện BVTV (1976) [20]; Nguyễn Văn Cảm và Hà Minh Trung (1980) [3] ở các tỉnh phắa Bắc ựã xác ựịnh trên rau họ hoa thập tự có 23 loài sâu hại thuộc 13 họ và 6 bộ. Trong 23 loài phát hiện thì chỉ có 14 loài gây hại rõ rệt.
Theo Hồ Khắc Tắn và cộng sự (1980) [17] ở Việt Nam có 4 loài sâu hại chủ yếu trên rau họ hoa thập tự, gồm: sâu tơ (Plutella
Fabr), sâu khoang (Prodenia litura Fabr) và rệp muội hại rau (Aphididae). Theo Phạm Thị Nhất (1993) [12], Nguyễn Thị Hoa (2001) [9] sâu hại rau họ hoa thập tự chủ yếu có 6 loài: sâu tơ, sâu khoang, sâu xám, bọ nhảy và sâu xanh bướm trắng, rệp muội. Theo Vũ Thị Hiển (2002) [8], thành phần sâu hại chinh trên rau cải ngọt vụ đông Xuân vùng Gia Lâm Ờ Hà Nội gồm có 7 loài: bọ nhảy, sâu tơ, sâu xanh bướm trắng, sâu khoang, sâu xám, rệp xám và rệp ựào.
Kết quả ựiều tra 3 năm 1995-1997 ở vùng ựồng bằng sông Hồng của Lê Văn Trịnh (1998) [18] ựã xác ựịnh ựược 31 loài côn trùng gây hại trên rau họ hoa thập tự với mức ựộ gây hại khác nhau, trong ựó 12 loài gây hại rõ rệt với 3 ựối tượng quan trọng nhất là: sâu tơ, sâu xanh bướm trắng và sâu khoang.
Các tác giả: Hồ Khắc Tắn (1980) [17]; Hồ Thị Thu Giang (2002) [7];Lê Thị Kim Oanh (2002) [13] ựều cho biết tại khu vực phắa Bắc số
lượng loài sâu hại là khá phong phú trong ựó có một số loài gây hại quan trọng là: sâu tơ, sâu khoang, sâu xanh bướm trắng, rệp xámẦ. Một vài năm gần ựây dòi ựục lá Liriomyza sativae B. với khả năng ăn tạp cao ựã trở thành một trong những ựối tượng gây hại quan trọng không chỉ trên rau họ hoa thập tự mà còn trên nhiều cây trồng màu khác.
Theo kết quả theo dõi của Lê Văn Trịnh và ctv (1998) [18] cho thấy, có 11 loài thiên ựịch xuất hiện trên các vùng trồng rau trong mùa
ựông, bao gồm 5 loài nhện (thuộc bộ nhện lớn Ờ Araneae); 3 loài côn trùng cánh cứng (Bộ Coleoptera); 2 loài ong ký sinh (Bộ Hymenoptera) và 1 loài nấm ký sinh (chưa xác ựịnh).
Theo Phạm Văn Lầm (2003) [11], từ năm 1981 Ờ 2002 Viện Bảo vệ thực vật ựã tiến hành thu thập và ựịnh danh ựược 64 loài thiên ựịch trên rau thập tự thuộc 6 bộ trong ựó có 30 loài thuộc bộ cánh màng.
1.4.2. Những nghiên cứu về bọ nhảy sọc cong vỏ lạc Phyllotreta striolata Fabricius hại rau họ hoa thập tự và biện pháp phòng trừ Fabricius hại rau họ hoa thập tự và biện pháp phòng trừ
Theo Hồ Khắc Tắn và cộng sự (1980) [17 ], Vũ Thị Hiển (2002) [8] bọ nhảy trưởng thành có kắch thước cơ thể dài 1,8 - 2,4mm, hình bầu dục, toàn thân màu ựen bóng, trên cánh có 2 vân sọc hình vỏ củ lạc màu trắng vàng. Thời gian sống của bọ nhảy trưởng thành rất dài, có thể tới 1 năm. Giai ựoạn từ khi vũ hoá ựến ựẻ trứng phụ thuộc nhiều vào ựiều kiện môi trường, có thể từ 15 - 79 ngày.
Sâu non ựẫy sức hình ống tròn dài 4mm, màu vàng nhạt. đầu hình bán cầu, 2 má màu nâu. Trên toàn cơ thể có các lông ngắn và thưa vàng. Có 3 ựôi chân ngực rất phát triển các ựốt ựều có u lồi, trên u có các lông nhỏ.
Nhộng hình bầu dục dài khoảng 2mm, màu vàng nhạt, mầm cánh và mầm chân sau rất dài, ựốt cuối cùng có 2 gai lồi.
Trứng ựược ựẻ vào trong ựất, kẽ nứt của gốc cây phần nằm dưới mặt
ựất hoặc rễ cây Trứng ựẻ riêng lẻ từng quả hoặc ựẻ thành nhóm 5 Ờ 6 quả. Trứng có hình bầu dục nhưng chiều dài chỉ khoảng 0,42 Ờ 0,45 mm; rộng khoảng 0,2 Ờ 0,3 mm. Khi mới ựẻ trứng có màu trắng vàng trong suột sau
ựục dần. Trong ựiều kiện nhiệt ựộ 26oC trứng phát dục từ 4 - 8 ngày.
Quy luật phát sinh gây hại của bọ nhảy có liên quan trực tiếp với một số yếu tố ngoại cảnh như nhiệt ựộ và ẩm ựộ. Nhiệt ựộ dưới 10oC và trên 34oC bọ nhảy ắt hoạt ựộng và tìm nơi ẩn náu. Ẩm ựộ không khắ trên 80% là thắch hợp cho bọ nhảy sinh trưởng và phát triển, dưới 80% sẽảnh hưởng rõ rệt ựến số lượng trứng ựẻ và tỉ lệ sâu sống. Mưa nhiều, bọ
nhảy ựẻ ắt và tỉ lệ nở cũng như tỉ lệ sống sót của sâu non thấp.
Do trưởng thành bọ nhảy sống lâu và ựẻ trứng kéo dài nên không tạo thành lứa rõ rệt. Hàng năm chúng phá hoại nhiều trên cây vụựông từ tháng 9 ựến tháng 4 năm sau nhưng thiệt hại nặng nhất vào tháng 2 ựến tháng 3.
Theo Phạm Thị Nhất (1993) [12], trưởng thành bọ nhảy có chiều dài cơ thể là 2 - 4mm, có tắnh giả chết, ưa thời tiết khô ấm. Bọ nhảy xuất hiện quanh năm, nhưng phá hại mạnh nhất vào tháng 3 trên cây rau họ
hoa thập tự. Mật ựộ trưởng thành bọ nhảy trên ựồng ruộng có sự dao
ựộng rất lớn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: mùa vụ, giai ựoạn sinh trưởng của cây, có khi mật ựộ lên tới 1000 (con/m2), làm giảm năng suất thương phẩm, thậm trắ làm thất thu hoàn toàn cho người trồng rau.
Theo Vũ Thị Hiển (2002) [8], bọ nhảy phát sinh gây hại quanh năm từ tháng 1 ựến tháng 12 trong năm 2000. Trên cây cải ngọt bọ nhảy phát sinh mạnh vào tháng 5 và tháng 10, mật ựộ từ 100 - 135 con/m2. Nhưng năm 2001 bọ nhảy phát sinh mạnh vào tháng 3, mật ựộ trưởng thành bọ
nhảy 107,5 con/m2. Bọ nhảy gây hại nặng trên cải xanh, cải củ hơn cải bắp, xu hào. Vùng chuyên canh bị bọ nhảy hại nặng hơn so vớivùng xen canh. Mật ựộ bọ nhảy bị giảm mạnh khi có mưa lớn, mưa kéo dài.
Bọ nhảy chủ yếu gây hại trên cây họ hoa thập tự nên việc dọn sạch tàn dư, luân canh cây trồng hợp lý là biện pháp phòng trừ bọ nhảy có hiệu quả cao. đồng thời các biện pháp này giảm chi phắ bảo vệ thực vật, giảm ô nhiễm môi trường, ựặc biệt là giảm ựược tồn dư thuốc trừ sâu trong sản phẩm.
Nông dân ở Việt Nam chủ yếu dùng biện pháp hoá học ựể trừ bọ
nhảy. Mấy năm gần ựây chúng ta mới mở rộng nghiên cứu và sử dụng các biện pháp khác trong phòng trừ bọ nhảy. Theo Nguyễn Thị Hoa (2002) [9] kết quả khảo nghiệm hiệu lực trừ bọ nhảy của một số thuốc như sau: Regent 800WG, nồng ựộ sử dụng là 0.01% có hiệu lực trừ bọ
nhảy cao nhất 98.2% tại thời ựiểm sau phun 5-7 ngày, tiếp ựến là Padan 95SP với nồng ựộ 0.25% (86.2-88.2%), thuốc trừ sâu sinh học Delfin WG nồng ựộ 0.1% cho hiệu lực thấp dưới 50% ựồng thời, thời
gian tác ựộng ngắn.
Theo Vũ Thị Hiển (2002) [8] ở vùng Gia Lâm - Hà Nội vụ đông năm 2001 người nông dân ựã sử dụng 11 loại thuốc ựể phòng trừ bọ
nhảy hại cải ngọt, trong ựó không có một loại thuốc nào là thuốc trừ sâu sinh học. Tác giả cũng ựưa ra kết luận chế phẩm Beauveria không có tác dụng ựối với sâu non bọ nhảy.
1.4.3. Những nghiên cứu về nấm Metarhizium
Ở nước ta, Trung tâm đấu tranh sinh học (Viện Bảo vệ thực vật) ựã nghiên cứu sản xuất nấm Metarhizium ựể phòng trừ một sốựối tượng cây trồng như: Rầy nâu hại lúa, châu chấu hại ngô, sâu ựo xanh hại ựay từ
những năm 1990 của thế kỷ 20 ... trong khoảng 5 năm nay Viện ựã thu
ựược nhiều kết quả quan trọng (Nguyễn Văn Vấn và cộng sự, 2005) [19].
đến nay Việt Nam ựã thu thập và phân lập, tuyển chọn ựược 28 chủng (10 chủng Beauveria bassiana. và 18 chủng Metarhizium anisopliae) trên các loài sâu hại khác nhau ở các tỉnh phắa Bắc và phắa Nam. Trong ựó
ựã chọn ựược 4 chủng có hiệu lực diệt côn trùng cao và hiện ựang ựược sử
dụng ựể sản xuất chế phẩm là 2 chủng Beauveria bassiana và Metarhizium
anisopliae ở phắa Bắc, 2 chủng Beauveria bassiana và Metarhizium
anisopliae ở phắa Nam. Trong những năm qua Trung tâm đấu tranh sinh học (Bảo vệ thực vật) ựã sản xuất ựược 2.355 kg Beauveria bassiana và 3.275 Metarhizium anisopliae sử dụng trừ sâu keo da láng, sâu khoang ăn lá
ựậu tương và sâu xanh ựục quả ựậu xanh với hiệu quả là 68.2- 72.3%(Beauveria bassiana), 69.2- 75.1% (Metarhizium anisopliae), trừ bọ
dừa ựạt 63.63- 81.42% (Metarhizium anisopliae) còn viện lúa ựồng bằng sông Cửu Long ựã sản xuất ựược 32175 kg chế phẩm Metarhizium anisopliae và 1265 kg Beauveria bassiana ựể phòng trừ sâu hại lúa, cây ăn quả và cây công nghiệp với hiệu quả phòng trừựạt 70-80%. Viện Bảo vệ
thực vật ựã ựăng ký ựược 2 chế phẩm vào danh mục thuốc bảo vệ thực vật
ựược phép sử dụng ở Việt Nam (Phạm Thị Thuỳ và cộng sự, 2008) [16], (Nguyễn Văn Vấn và cộng sự, 2005) [19].
đối với các tỉnh phắa Bắc trong phòng thắ nghiệm, hiệu lực của chế
phẩm nấm Metarhizium anisopliae trên sâu xanh hại bồ ựề ựạt 68.5% sau 10 ngày thắ nghiệm. Trên bọ xắt nhãn vải 81.7% sau 12 ngày thắ nghiệm. Nhưng hiệu lực của chế phẩm này lại ựạt khá cao khi thực hiện
ở ngoài ựồng ruộng. Cụ thể là hiệu lực với sâu xanh hại bồ ựề Yên Bái 89.7% sau 10 ngày thắ nghiệm (Metarhizium anisopliae) (Nguyễn Văn Vấn và cộng sự, 2005) [19].
Tại các tỉnh phắa Nam, hiệu lực của các chế phẩm Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana trong nhà lưới nhìn chung ựạt cao hơn trên ựồng ruộng (chẳng hạn Beauveria bassiana ựạt hiệu lực 85.56- 91%
ựối với bọ cánh cứng hại dừa khi thực hiện trong nhà lưới. Còn
Metarhizium anisopliae có hiệu lực 69- 91% ựối với côn trùng chắch hút trên ựồng ruộng và thực tế cho thấy ựối với sâu non của côn trùng cánh vảy thì Beauveria bassiana có hiệu lực hơn Metarhizium anisopliae,
nhưng ựối với côn trùng chắch hút, mối và bọ cánh cứng hại dừa thì hiệu quả phòng trừ chưa cao (Nguyễn Văn Vấn và cộng sự, 2005) [19].
Trong chi Metarhizium có 2 loại nấm ựược xác ựịnh nhiều trong việc gây bệnh trên côn trùng là: Metarhizium flavoviride Gams và Metarhizium anisopliae Sorok (Ma), vì nấm có mầu xanh lục hay màu lục gọi là nấm lục cương.
Thắ nghiệm trong phòng với châu chấu Nomodacris succincta, nấm
M.anisopliae sau 10 ngày xử lý gây chết 84,6%, còn nấm M.flavoviride gây chết 10% châu chấu thắ nghiệm sau 7 ngày. Ởựiều kiện trong phòng, nấm M.flavoviride có tác dụng tiêu diệt 3 loài sâu hại rau là sâu tơ, sâu