3. ðỐ IT ƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYấN LIỆU VÀ
3.4.4.Phương phỏp làm phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (Phản
ứng HI)
* Nguyờn lý của phản ứng:
Virus cỳm gia cầm cú ủặc tớnh gõy ngưng kết hồng cầu một số loài gia sỳc, gia cầm. Nếu gặp ủược khỏng thểủặc hiệu tương ứng, thỡ virus bị khỏng thể trung hũa, khụng cũn virus ủể tiếp xỳc với hồng cầu, hay núi cỏch khỏc khỏng thểủó ngăn trở ngưng kết hồng cầu của virus. Cũn nếu virus khụng gặp khỏng thể ủặc hiệu tương ứng, virus sẽ khụng bị trung hũa và virus sẽ làm hồng cầu ngưng kết lại với nhau.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...41
* Ứng dụng:
Trong bệnh cỳm gia cầm phản ứng HI thường ủược sử dụng ủể: - Giỏm ủịnh serotype virus cỳm gia cầm phõn lập ủược.
- Phỏt hiện khỏng thể cỳm gia cầm.
- Xỏc ủịnh hàm lượng khỏng thể cỳm gia cầm sau khi sử dụng vacxin phũng bệnh.
* Nguyờn liệu
- Khỏng nguyờn chuẩn: là virus cỳm H5N1 vụ hoạt ủó ủược xỏc ủịnh hiệu giỏ gõy ngưng kết hồng cầu (ủơn vị HA). Khỏng nguyờn dựng cho phản
ứng HI là 4 ủơn vị HA/25àl.
+ Pha khỏng nguyờn 4 HA/25àl: lấy ủộ pha loóng cuối cựng cú phản ứng ngưng kết hồng cầu 1 HA nhõn với 4.
+ Chuẩn ủộ khỏng nguyờn 4 HA: Sau khi pha loóng khỏng nguyờn 4 HA phải ủược chuẩn ủộ lại. Tiến hành như phản ứng xỏc ủịnh hiệu giỏ HA.
Pha chuẩn: ngưng kết xẩy ra ở 2 giếng ủầu.
Pha khụng chuẩn: nếu ngưng kết ủến giếng thứ 3 tức là thừa khỏng nguyờn. Như vậy hỗn dịch khỏng nguyờn cú 8 HA phải ủược pha loóng (cú thể gấp ủụi) ủể cú ngưng kết ủến giếng thứ 2. Khỏng nguyờn loóng ngưng kết chỉở giếng 1 tức là thiếu khỏng nguyờn cú thể thờm một lượng khỏng nguyờn với lượng khỏng nguyờn ban ủầu ủể cú ngưng kết ở giếng thứ 2.
- Huyết thanh cần kiểm tra: ðược tỏch từ mỏu của ngan sau khi dựng vacxin. Bảo quản ở -860C.
- Hồng cầu gà 0,5%.
* Cỏch tiến hành phản ứng
Thực hiện trờn tấm nhựa Microtest plates 96 lỗ, mỗi mẫu dựng một dóy lỗ. - Cho 25 àl nước sinh lý vào cỏc lỗ từ 2 ủến lỗ 12.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...42
cỏc bậc pha loóng 1/2, 1/4, 1/8, 1/16... từ lỗ 1 ủến lỗ 11
- Cho 25àl khỏng nguyờn virus cỳm vào tất cả cỏc lỗ cú chứa 4 ủơn vị HA. Lắc nhẹ ủĩa, ủể nhiệt ủộ phũng trong 20-30 phỳt cho khỏng nguyờn và khỏng thể (nếu cú) kết hợp với nhau.
- Cho 50àl hỗn dịch hồng cầu gà 0,5% vào tất cả cỏc dóy lỗ. Lắc nhẹ tấm nhựa, ủểở nhiệt ủộ phũng 20 phỳt.
Làm ủối chứng:
ðối chứng dương: cho 50àl nước sinh lý và 50àl hồng cầu gà 0,5%.
ðối chứng õm: cho 50àl khỏng nguyờn và 50àl hồng cầu gà 0,5%.
Sau khi ủ, cho 50àl hồng cầu gà 0,5% vào tất cả cỏc lỗ phản ứng. Lắc nhẹủĩa, ủể nhiệt ủộ phũng trong 20 phỳt.
* ðọc kết quả: Khi lỗ ủối chứng dương hồng cầu lắng xuống ủỏy thành cục trũn thỡ ủọc kết quả:
- Phản ứng HI dương tớnh: Hồng cầu lắng xuống ủỏy lỗ thành cục trũn
ủỏ nước trong ở bờn trờn.
- Phản ứng HI õm tớnh: Hồng cầu bị ngưng kết rải ủều ởủỏy lỗ.
- Hiệu giỏ của phản ứng HI: là ủộ pha loóng huyết thanh cao nhất mà ở ủú vẫn cũn khả năng ức chế ngưng kết hồng cầu.