3. ðỐ IT ƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYấN LIỆU VÀ
3.4.3. Phương phỏp làm phản ứng HA
Nguyờn lý của phản ứng
Trờn bề mặt của virus cỳm cú khỏng nguyờn hemagglutinin cú tỏc dụng gắn kết cỏc hồng cầu lại với nhau và ta cú thể quan sỏt hiện tượng này bằng mắt thường.
* Ứng dụng:
- Chuẩn ủộ khỏng nguyờn chuẩn.
- Chuẩn ủộ khỏng nguyờn (virus) phõn lập từ bệnh phẩm. - Tớnh 4 ủơn vị HA dựng trong phản ứng HI.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...39
* Nguyờn liệu
- Khỏng nguyờn. + Virus cần phõn lập.
+ Virus chuẩn ủó biết: Inactivated antigen H5N1 (Veterinary laboratories agency) ủược chế bằng cỏch: virus cỳm subtýp H5N1 ủược tiờm truyền vào xoang niệu mụ của phụi gà. Sau khi virus nhõn lờn, thu hoạch nước trứng, vụ hoạt virus bằng β propiolacton. Khi dựng pha khỏng nguyờn cho phản ứng HI là ủơn vị 4 HA/25àl.
Hồng cầu gà 0,5%: ủược chế từ mỏu gà trống trưởng thành, khoẻ mạnh, khụng ủược tiờm vacxin cỳm gia cầm và newcastle, cú phản ứng HI õm tớnh.
* Cỏch làm: Dựng bơm kim tiờm vụ trựng hỳt sẵn 1ml dung dịch Citrat
natri 4% sau ủú lấy mỏu ở tĩnh mạch cỏnh gà. Cho mỏu vào ống nghiệm rồi ly tõm 1500 vũng/phỳt trong 15 phỳt. Sau khi ly tõm xong hỳt bỏ huyết tương, cho thờm nước sinh lý (NaCl 0,85%) vào ống nghiệm, lắc nhẹ ủều. Làm như
trờn 3 lần ủể rửa hồng cầu, lần ly tõm cuối cựng hỳt bỏ phần nước trong phớa trờn. Lấy 0,5 ml hồng cầu ủặc cho vào 99,5 ml nước sinh lý (pH=7,2) lắc nhẹ
sẽủược hồng cầu 0,5%. Bảo quản hồng cầu ở nhiệt ủộ 4 - 80C, hồng cầu sau khi pha cú thể dựng trong 4 - 5 ngày. Hồng cầu bị dung huyết thỡ loại bỏ
khụng dựng.
* Cỏch tiến hành phản ứng
Hai phản ứng này ủược tiến hành trên tấm nhựa vi ng−ng kết (Microtest plates) 96 lỗ đáy hình chữ U dung tích mỗi lỗ 0,1ml.
Phản ứng gồm cỏc bước sau:
- Cho 50àl nước sinh lý vào cỏc lỗ từ 2 - 12 giếng của ủĩa. - Cho 100àl nước trứng chứa virus vào lỗ 1.
- Pha loóng virut bằng cỏc bậc pha loóng 1/2, 1/4, 1/8, 1/16…ủến lỗ 11 rồi hỳt bỏủi 50 àl.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...40
- Cho 50àl hồng cầu vào tất cả cỏc giếng cú chứa virut ủó pha loóng. - Giếng thứ 12 làm ủối chứng hồng cầu: nhỏ 50àl NaCl 0,85 % vào lỗ sau ủú nhỏ 50àl hồng cầu 0,5%; - Lắc nhẹủĩa, ủể nhiệt ủộ phũng trong 20 phỳt. * ðọc kết quả: Phản ứng dương tớnh: Hồng cầu bị ngưng kết rải ủều ởủỏy giếng. Phản ứng õm tớnh: Hồng cầu lắng xuống ủỏy giếng thành cục trũn giống ủối chứng õm.
- Hiệu giỏ phản ứng HA: là ủộ pha loóng virut cao nhất mà ở ủú vẫn cũn ngưng kết hồng cầu, người ta gọi ủú là 1 ủơn vị HA.
- Nếu phản ứng HA dương tớnh chứng tỏ trong nước trứng cú chứa virus gõy ngưng kết hồng cầu. Tiếp tục làm phản ứng HI giỏm ủịnh virus cỳm với khỏng huyết thanh chuẩn của một số subtype virus cỳm.
- Nếu phản ứng HA õm tớnh mà phụi chết, cú bệnh tớch phụi thỡ phải lấy nước trứng tiờm truyền lần 2.
- Nếu phản ứng HA õm tớnh mà phụi phỏt triển bỡnh thường, khụng cần làm lại.