Việc chẩn ủoỏn cỳm gia cầm do nhiễm virus týp A chủ yếu là phải phõn lập và ủịnh danh virus kết hợp với chẩn ủoỏn dựa trờn triệu chứng lõm sỏng, xỏc ủịnh bệnh tớch ủại thể, vi thể và dịch tễ học với một số phản ứng huyết thanh học theo chẩn ủoỏn thường quy của Trung Tõm chẩn ủoỏn thỳ y trung ương Ờ Cục thỳ y, sơ ủồ chẩn ủoỏn phũng thớ nghiệm của bờnh cỳm gia cầm hiện nay như sau: Xột nghiệm nhanh: BD Dir hoặc Quickvue Bệnh phẩm Phủ tạng: Phổi, khớ quản, gan,.. Huyết thanh Dịch họng, ổ nhớp Tỡm khỏng thể cỳm Phõn lập virus: trờn trứng hoặc tế bào Giỏm ủịnh Huyết thanh học Rt - pcr
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...23
* Phõn lập virus.
Là một chẩn ủoỏn cơ bản, cú ý nghĩa quyết ủịnh. để phõn lập virus thường sử dụng mẫu bệnh phẩm là phổi, khớ quản, nóo, lỏch. Việc phõn lập
ủược thực hiờn trờn mụi trường tế bào thận chú (Madin Ờ Darby Canine Kidney Cell - MDCK) hoặc trờn phụi trứng gà.
* Phõn lập virus trờn mụi trường tế bào.
để cú thể lõy nhiễm bệnh phẩm mụi trường tế bào trước hết phải thực hiện nuụi cấy trờn chai TỜ25 trong mụi trường phỏt triển tế bào với cỏc hoỏ chất nguyờn liệu cần thiết. Sau khi thảm tế bào mọc từ 90% trở lờn sau 24-72 giờ cú thể sử dụng ủể phõn lập virus bằng việc tiờm truyền huyễn dịch bệnh phẩm ủó ủược xử lý khỏng sinh hoặc qua lọc lờn bề mặt tế bào. Quỏ trỡnh lõy nhiễm bệnh phẩm ủược bổ sung mụi trường nuụi cấy virus (D Ờ MEM với TCPK treaed trypsin) trong tủ ấm CO2. Tiến hành quan sỏt bệnh tớch tế bào (CPU) hàng ngày. Cú thể sử dụng phản ứng HA ủể kiểm tra bằng cỏch thu hoạch dịch nổi trong chai tế bào ủó cấy virus sau 1-7 ngày. Nếu õm tớnh cú thể
cấy chuyển trờn tế bào thờm 2-3 lần, mẫu phõn lập trờn tế bào ủược bảo quản trong tủ õm 700C (-700C).
* Phõn lập virus trờn phụi trứng.
Tiờm 0,1 - 0,3ml nước bệnh phẩm vào tỳi niệu của phụi gà 9 - 11 ngày tuổi, hàn kớn, mỗi mẫu bệnh phẩm tiờm cho 3 trứng và tiếp tục cho ấp ở nhiệt
ủộ 370C trong 7 ngày. Một số ớt chủng virus cú ủộc lực cao cú thể gõy chết phụi khoảng 18-24 giờ trứng thu hoạch ủểở nhiệt ủộ 40C qua một ủờm. Virus nhõn lờn trong nước trứng cú hiện tượng ngưng kết hồng cầu gà. Nếu khụng gõy ngưng kết hồng cầu thỡ cú thể lấy nước trứng thu ủược tiờm lần 2 cho phụi gà. Phần lớn cỏc phụi bị tạp khuẩn sẽ chết trước 24 giờ phải bỏ ủi. Những phụi sống sau 24h tiếp tục ủược theo dừi ủến 72h. Lấy nước phụi từ
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...24
những phụi chết trong khoảng 48h và sau 48h hoặc từ phụi chưa chết ủến 72h vào việc giỏm ủịnh virus. đõy là khoảng thời gian mà số lượng virus cỳm (nếu cú) ủó ủạt ủến mức lý tưởng. (Trước khi thu hoạch nước trứng phải cất trứng vào tủ lạnh 40 C trong 4 giờ hoặc ủể tủ ấm trong 20 phỳt ở nhiệt ủộ - 200C. Nước trứng (nước niệu mụ phụi trứng) ủược cho vào ống nghiệm 10 ml và bảo quản trong tủ õm -700C.)
Mẫu phõn lập ủược kiểm tra bằng phản ứng HA nếu õm tớnh cú thể cấy chuyển trờn phụi trứng gà thờm 2-3 ủợt.
* định danh virus.
Sau khi phõn lập ủược virus từ mụi trường tế bào hoặc trờn phụi trứng gà, cú thể giỏm ủịnh virus bằng cỏc HI test ủể giỏm ủịnh subtype H; NI test ủể xỏc
ủịnh subtype N hoặc bằng phương phỏp RT Ờ PCR ủể xỏc ủịnh subtype H, N.