3. ðỐ IT ƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYấN LIỆU VÀ
3.2.4.Xỏc ủị nh hiệu lực của vacxin cỳm H5N1 trờn ủ àn ngan bằng phương
phỏp cụng cường ủộc.
3.2.5. Khuyến cỏo lịch dựng vacxin H5N1 phũng bệnh cỳm cho ngan Phỏp
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...36
3.3. Nguyờn liệu
- Vacxin cỳm gia cầm H5N1 RE-1 của Trung quốc. đõy là loại vacxin ủó
ủược thử nghiệm thành cụng trờn gà, vịt và ủược phộp sử dụng trong phũng chống dịch cỳm gia cầm ở nước ta.
- Virus cỳm cường ủộc: Virus H5N1 (A/chicken/VietNam/NCVD/029) thể ủộc lực cao thuộc phõn nhỏnh HA clade 2.3.4 ủó ủược lựa chọn và thử
nghiệm trong nhiều thớ nghiệm trước. Virus ủược chuẩn ủộ và chia liều cất giữ ở nhiệt ủộ -700C ủến khi sử dụng. Liều virus dựng cho cụng cường ủộc là 106TCID50/ml/con và thực hiện tại Trung tõm Chẩn ủoỏn Thỳ y Trung Ương
- Hồng cầu gà: lấy từ mỏu gà trống khoẻ, khụng ủược tiờm vacxin cỳm gia cầm và newcastle, cú phản ứng HI õm tớnh. Sử dụng hồng cầu gà 0,5%.
- Nước sinh lý 0,85% vụ trựng.
3.4. Phương phỏp nghiờn cứu
3.4.1 Bố trớ thớ nghiệm
+ Thớ nghiệm 1. Kiểm tra hàm lượng khỏng thể chủủộng cỳm gia cầm trờn
ủàn ngan bố mẹ sau khi tiờm vacxin 1 thỏng; 2 thỏng; 3 thỏng; 4 thỏng; 5 thỏng; 6 thỏng, kiểm tra hàm lượng khỏng thể cỳm gia cầm trong mỏu bằng phản ứng HI ủồng thời kiểm tra khỏng thể thụủộng ở ngan con 1 ngày tuổi nở
từ ngan mẹ sau khi tiờm vacxin ở cỏc thời ủiểm trờn và xỏc ủịnh mối tương quan giữa hàm lượng khỏng thể chủ ủộng của ngan mẹ và hàm lượng khỏng thể thụủộng của ngan con.
3.1 Mối tương quan giữa hàm lượng khỏng thể cỳm gia cầm chủ ủộng ngan mẹ và khỏng thể thụủộng ở ngan con.
N Kiểm tra hiệu giỏ HI (log2) của ngan mẹ sau khi tiờm vacxin (thỏng)
30 1 2 3 4 5 6
Kiểm tra hiệu giỏ HI (log2) của ngan con ở 1 ngày tuổi từủàn ngan mẹ sau khi tiờm vacxin (thỏng)
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...37
+ Thớ nghiệm 2. Xỏc ủịnh diễn biến khỏng thể thụ ủộng cỳm gia cầm ở
ngan con. (n=10)
Ngan mẹ tại cỏc thời ủiểm kiểm tra khỏng thể cỳm gia cầm ở thớ nghiệm 1, sau 1; 2; 3; 4; 5; 6 thỏng sau khi tiờm vacxin tiến hành thu trứng
ủem ấp sau ủú kiểm tra khỏng thể thụ ủộng ở ngan con thụng qua hiệu giỏ phản ứng HI ở cỏc thời ủiểm 1; 3; 7; 10; 14; 17 ... ngày tuổi cho tới khi hết hoàn toàn lượng khỏng thể thụủộng.
+ Thớ nghiệm 3: Xỏc ủịnh thời ủiểm sử dụng vacxin cỳm H5N1 cho ngan con. (n=30/ủàn)
Bảng 3.2 Hiệu giỏ khỏng thể của ngan con dựng vacxin cỳm H5N1 lần 1 và lần 2 (nở từ trứng của ngan mẹ sau khi tiờm vacxin
cho ngan mẹ 1, 3 và 5 thỏng)
Hiệu giỏ khỏng thể của ngan con khi dựng vacxin cỳm H5N1 Nở từ ngan mẹ sau khi
tiờm vacxin 1 thỏng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nở từ ngan mẹ sau khi tiờm vacxin 3 thỏng
Nở từ ngan mẹ
sau khi tiờm vacxin 5 thỏng Thời ủiểm tiờm (ngày) đàn 1 đàn 2 đàn 3 đàn 4 đàn 5 đàn 6 đàn 7 đàn 8 Lần 1 7 14 21 7 14 21 7 14 Lần 2 35 42 49 35 42 49 35 42 - Lấy mẫu mỏu kiểm tra hiệu giỏ HI sau khi sử dụng vacxin cỳm gia cầm lần 1 ủược 14, 21, 28Ầ ngày.
- Lấy mẫu mỏu kiểm tra hiệu giỏ HI sau khi sử dụng vacxin cỳm gia cầm lần 2 ủược 14, 21, 35 ngày.
Mọi chếủộ chăm súc nuụi dưỡng ở cỏc thớ nghiệm là như nhau.
+ Thớ nghiệm 4: Tiến hành cụng cường ủộc tại Trung tõm Chẩn ủoỏn thỳ y Trung ương.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...38
Bảng 3.3 Kết quả xỏc ủịnh hiệu lực của vacxin cỳm H5N1 trờn ủàn ngan bằng phương phỏp cụng cường ủộc
Lụ Ngày cụng cường ủộc Số lượng ngan ủem cụng Thời gian theo dừi Thớ nghiệm Sau khi tiờm vacxin
lần 2 ủược 21 ngày 10 12
đối chứng Khụng tiờm vacxin 5 12
Trước khi cụng và sau khi cụng cường ủộc kiểm tra HI của cả 2 lụ. Theo dừi, triệu chứng, cỏc biểu hiện bất thường khỏc, bệnh tớch và tỷ lệ bảo hộ...
Thớ nghiệm ủược tiến hành tại Trung tõm chẩn ủoỏn thỳ y Trung ương Ờ Cục thỳ y.
3.4.2. Phương phỏp lấy mỏu ngan con:
Dựng xylanh vụ trựng lấy mỏu tim hoặc mỏu từ tĩnh mạch cổ, cỏnh, ủể
nghiờng và chắt huyết thanh, ủỏnh dấu mẫu mỏu ủể gửi Trung tõm Chẩn ủoỏn thỳ y Trung ương ủể xỏc ủịnh hàm lượng khỏng thể bằng phản ứng HI (Hemagglutination inhibition test).
3.4.3. Phương phỏp làm phản ứng HA
Nguyờn lý của phản ứng
Trờn bề mặt của virus cỳm cú khỏng nguyờn hemagglutinin cú tỏc dụng gắn kết cỏc hồng cầu lại với nhau và ta cú thể quan sỏt hiện tượng này bằng mắt thường.
* Ứng dụng:
- Chuẩn ủộ khỏng nguyờn chuẩn.
- Chuẩn ủộ khỏng nguyờn (virus) phõn lập từ bệnh phẩm. - Tớnh 4 ủơn vị HA dựng trong phản ứng HI.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...39
* Nguyờn liệu
- Khỏng nguyờn. + Virus cần phõn lập.
+ Virus chuẩn ủó biết: Inactivated antigen H5N1 (Veterinary laboratories agency) ủược chế bằng cỏch: virus cỳm subtýp H5N1 ủược tiờm truyền vào xoang niệu mụ của phụi gà. Sau khi virus nhõn lờn, thu hoạch nước trứng, vụ hoạt virus bằng β propiolacton. Khi dựng pha khỏng nguyờn cho phản ứng HI là ủơn vị 4 HA/25àl.
Hồng cầu gà 0,5%: ủược chế từ mỏu gà trống trưởng thành, khoẻ mạnh, khụng ủược tiờm vacxin cỳm gia cầm và newcastle, cú phản ứng HI õm tớnh.
* Cỏch làm: Dựng bơm kim tiờm vụ trựng hỳt sẵn 1ml dung dịch Citrat (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
natri 4% sau ủú lấy mỏu ở tĩnh mạch cỏnh gà. Cho mỏu vào ống nghiệm rồi ly tõm 1500 vũng/phỳt trong 15 phỳt. Sau khi ly tõm xong hỳt bỏ huyết tương, cho thờm nước sinh lý (NaCl 0,85%) vào ống nghiệm, lắc nhẹ ủều. Làm như
trờn 3 lần ủể rửa hồng cầu, lần ly tõm cuối cựng hỳt bỏ phần nước trong phớa trờn. Lấy 0,5 ml hồng cầu ủặc cho vào 99,5 ml nước sinh lý (pH=7,2) lắc nhẹ
sẽủược hồng cầu 0,5%. Bảo quản hồng cầu ở nhiệt ủộ 4 - 80C, hồng cầu sau khi pha cú thể dựng trong 4 - 5 ngày. Hồng cầu bị dung huyết thỡ loại bỏ
khụng dựng.
* Cỏch tiến hành phản ứng
Hai phản ứng này ủược tiến hành trên tấm nhựa vi ng−ng kết (Microtest plates) 96 lỗ đáy hình chữ U dung tắch mỗi lỗ 0,1ml.
Phản ứng gồm cỏc bước sau:
- Cho 50àl nước sinh lý vào cỏc lỗ từ 2 - 12 giếng của ủĩa. - Cho 100àl nước trứng chứa virus vào lỗ 1.
- Pha loóng virut bằng cỏc bậc pha loóng 1/2, 1/4, 1/8, 1/16Ầủến lỗ 11 rồi hỳt bỏủi 50 àl.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...40
- Cho 50àl hồng cầu vào tất cả cỏc giếng cú chứa virut ủó pha loóng. - Giếng thứ 12 làm ủối chứng hồng cầu: nhỏ 50àl NaCl 0,85 % vào lỗ sau ủú nhỏ 50àl hồng cầu 0,5%; - Lắc nhẹủĩa, ủể nhiệt ủộ phũng trong 20 phỳt. * đọc kết quả: Phản ứng dương tớnh: Hồng cầu bị ngưng kết rải ủều ởủỏy giếng. Phản ứng õm tớnh: Hồng cầu lắng xuống ủỏy giếng thành cục trũn giống ủối chứng õm.
- Hiệu giỏ phản ứng HA: là ủộ pha loóng virut cao nhất mà ở ủú vẫn cũn ngưng kết hồng cầu, người ta gọi ủú là 1 ủơn vị HA.
- Nếu phản ứng HA dương tớnh chứng tỏ trong nước trứng cú chứa virus gõy ngưng kết hồng cầu. Tiếp tục làm phản ứng HI giỏm ủịnh virus cỳm với khỏng huyết thanh chuẩn của một số subtype virus cỳm.
- Nếu phản ứng HA õm tớnh mà phụi chết, cú bệnh tớch phụi thỡ phải lấy nước trứng tiờm truyền lần 2.
- Nếu phản ứng HA õm tớnh mà phụi phỏt triển bỡnh thường, khụng cần làm lại.
3.4.4. Phương phỏp làm phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (Phản
ứng HI)
* Nguyờn lý của phản ứng:
Virus cỳm gia cầm cú ủặc tớnh gõy ngưng kết hồng cầu một số loài gia sỳc, gia cầm. Nếu gặp ủược khỏng thểủặc hiệu tương ứng, thỡ virus bị khỏng thể trung hũa, khụng cũn virus ủể tiếp xỳc với hồng cầu, hay núi cỏch khỏc khỏng thểủó ngăn trở ngưng kết hồng cầu của virus. Cũn nếu virus khụng gặp khỏng thể ủặc hiệu tương ứng, virus sẽ khụng bị trung hũa và virus sẽ làm hồng cầu ngưng kết lại với nhau.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...41
* Ứng dụng:
Trong bệnh cỳm gia cầm phản ứng HI thường ủược sử dụng ủể: - Giỏm ủịnh serotype virus cỳm gia cầm phõn lập ủược.
- Phỏt hiện khỏng thể cỳm gia cầm.
- Xỏc ủịnh hàm lượng khỏng thể cỳm gia cầm sau khi sử dụng vacxin phũng bệnh.
* Nguyờn liệu
- Khỏng nguyờn chuẩn: là virus cỳm H5N1 vụ hoạt ủó ủược xỏc ủịnh hiệu giỏ gõy ngưng kết hồng cầu (ủơn vị HA). Khỏng nguyờn dựng cho phản
ứng HI là 4 ủơn vị HA/25àl.
+ Pha khỏng nguyờn 4 HA/25àl: lấy ủộ pha loóng cuối cựng cú phản ứng ngưng kết hồng cầu 1 HA nhõn với 4. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Chuẩn ủộ khỏng nguyờn 4 HA: Sau khi pha loóng khỏng nguyờn 4 HA phải ủược chuẩn ủộ lại. Tiến hành như phản ứng xỏc ủịnh hiệu giỏ HA.
Pha chuẩn: ngưng kết xẩy ra ở 2 giếng ủầu.
Pha khụng chuẩn: nếu ngưng kết ủến giếng thứ 3 tức là thừa khỏng nguyờn. Như vậy hỗn dịch khỏng nguyờn cú 8 HA phải ủược pha loóng (cú thể gấp ủụi) ủể cú ngưng kết ủến giếng thứ 2. Khỏng nguyờn loóng ngưng kết chỉở giếng 1 tức là thiếu khỏng nguyờn cú thể thờm một lượng khỏng nguyờn với lượng khỏng nguyờn ban ủầu ủể cú ngưng kết ở giếng thứ 2.
- Huyết thanh cần kiểm tra: được tỏch từ mỏu của ngan sau khi dựng vacxin. Bảo quản ở -860C.
- Hồng cầu gà 0,5%.
* Cỏch tiến hành phản ứng
Thực hiện trờn tấm nhựa Microtest plates 96 lỗ, mỗi mẫu dựng một dóy lỗ. - Cho 25 àl nước sinh lý vào cỏc lỗ từ 2 ủến lỗ 12.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...42
cỏc bậc pha loóng 1/2, 1/4, 1/8, 1/16... từ lỗ 1 ủến lỗ 11
- Cho 25àl khỏng nguyờn virus cỳm vào tất cả cỏc lỗ cú chứa 4 ủơn vị HA. Lắc nhẹ ủĩa, ủể nhiệt ủộ phũng trong 20-30 phỳt cho khỏng nguyờn và khỏng thể (nếu cú) kết hợp với nhau.
- Cho 50àl hỗn dịch hồng cầu gà 0,5% vào tất cả cỏc dóy lỗ. Lắc nhẹ tấm nhựa, ủểở nhiệt ủộ phũng 20 phỳt.
Làm ủối chứng:
đối chứng dương: cho 50àl nước sinh lý và 50àl hồng cầu gà 0,5%.
đối chứng õm: cho 50àl khỏng nguyờn và 50àl hồng cầu gà 0,5%.
Sau khi ủ, cho 50àl hồng cầu gà 0,5% vào tất cả cỏc lỗ phản ứng. Lắc nhẹủĩa, ủể nhiệt ủộ phũng trong 20 phỳt.
* đọc kết quả: Khi lỗ ủối chứng dương hồng cầu lắng xuống ủỏy thành cục trũn thỡ ủọc kết quả:
- Phản ứng HI dương tớnh: Hồng cầu lắng xuống ủỏy lỗ thành cục trũn
ủỏ nước trong ở bờn trờn.
- Phản ứng HI õm tớnh: Hồng cầu bị ngưng kết rải ủều ởủỏy lỗ.
- Hiệu giỏ của phản ứng HI: là ủộ pha loóng huyết thanh cao nhất mà ở ủú vẫn cũn khả năng ức chế ngưng kết hồng cầu.
3.4.5. Xử lý số liệu
Số liệu ủược xử lý theo phương phỏp thống kờ sinh học bằng chương trỡnh Microsoft Excel.
- Cụng thức tớnh tỷ lệ bảo hộ của vacxin:
Số mẫu ủạt HLKT bảo hộ≥ 4log2
Tỷ lệ bảo hộ (%) = x 100 Tổng số mẫu kiểm tra
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...43
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả kiểm tra khỏng thể cỳm gia cầm chủ ủộng ở ngan mẹ và thụủộng ở ngan con nuụi tại Trung tõm nghiờn cứu gia cầm Thuỵ ủộng ở ngan con nuụi tại Trung tõm nghiờn cứu gia cầm Thuỵ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương.
Trong quỏ trỡnh sử dụng vacxin tạo miễn dịch chủ ủộng cho ủộng vật núi chung, gia cầm núi riờng, sự cú mặt của khỏng thể thụ ủộng ủó ảnh hưởng
ủến lượng khỏng thểủược sản sinh ra.
Ở bệnh Newcastle, Alexander (1991) [29] khi nghiờn cứu cho biết: Việc sử dụng vacxin lần ủầu cho gà, khỏng thể thụ ủộng sẽ trung hoà một số
virus vacxin. Theo Skeeles (1979) [63] ủể sử dụng vacxin Gumboro ủạt hiệu quả cao, hiệu giỏ khỏng thể thụủộng lỳc ủú phải nhỏ hơn 1/64.
đối với ủộng vật cú vỳ, khỏng thể thụ ủộng ủược truyền từ mẹ sang con qua nhau thai và sữa ủầu, ở gia cầm nú ủược truyền ngay trong quỏ trỡnh hỡnh thành trứng. Khỏng thể cú trong lũng ủỏ khi trứng ủược ủẻ ra và xõm nhập vào vũng tuần hoàn của con non ủể bảo vệ chỳng trong những tuần tuổi
ủầu. (Trần Thị Lan Hương, 2001) [16]
Trong bệnh cỳm gia cầm ủể sử dụng vacxin phũng bệnh cỳm gia cầm cho ủàn ngan con ủạt hiệu quả cao thỡ việc xỏc ủịnh lượng khỏng thể chủ ủộng ở ủàn ngan mẹ và lượng khỏng thể thụủộng ở ủàn ngan con là một việc làm cần thiết. Chỳng tụi ủó tiến hành nghiờn cứu mối tương quan giữa hàm lượng khỏng thể cỳm của ủàn ngan mẹ với khỏng thể thụủộng ở ngan con và diễn biến khỏng thể thụủộng ởủàn ngan con.
4.1.1. Tương quan giữa hàm lượng khỏng thể cỳm gia cầm chủ ủộng ở
ngan mẹ và thụủộng ở ngan con.
Thớ nghiệm ủược thực hiờn trờn ủàn ngan Phỏp sử dụng vacxin cỳm gia cầm H5N9 vào cỏc thời ủiểm 14; 42 và 165 ngày tuổi. Sau khi tiờm vacxin lõấy
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...44
mẫu mỏu dựng phản ứng HI ủể xỏc ủịnh hàm lượng khỏng thể cỳm gia cầm chủ ủộng của ngan mẹ và lượng khỏng thể thụủộng của ngan con 1 ngày tuổi. Kết quảủược trỡnh bày ở bảng 4.1.
Qua theo dừi 30 ngan mẹ sau khi sử dụng vacxin ở thời ủiểm 165 ngày tuổi ủược 1 thỏng cho thấy: 100% số ngan ủều cú khỏng thể cỳm trong mỏu ngan với hàm lượng cao; biểu hiện ở số mẫu huyết thanh cú hiệu giỏ HI từ 5 log2ủến 8 log2.
Theo OIE nếu gia cầm cú hiệu giỏ HI ≥ 4 log2 thỡ ủược coi là cú khả năng bảo hộ với bệnh.
Qua 30 con ngan mẹ sau khi tiờm vacxin cỳm 1 thỏng chỳng tụi nhận thấy 100% ngan mẹ theo dừi cú khả năng bảo hộ với bệnh ở mức ủộ cao.
Ở ủàn ngan con, tại thời ủiểm 1 ngày tuổi 100% số ngan con cú khỏng thể thụủộng với 100% cú hiệu giỏ HI cao từ 4 log2 ủến 6 log2. So sỏnh hiệu giỏ