3. Đối t−ợng, địa điểm, thời gian, nội dung và
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
* Hóa chất:
- Dung dịch Dulbeco's Modified Eagle Medium.
- Một số loại axit hữu cơ: Axit Lactic (C3H6O3), Axit Axetic (C2 H4O2,
CH3COOH), Axit Oxalic [C2H2O4, (COOH) 2].
- Thuốc kháng sinh Fumagillin (Fumidil- B,C26H34O7 ).
* Vật liệu nghiên cứu:
- Các đàn ong ngoại Apis mellifera
- Kính hiển vi, tủ ấm, tủ định ôn, cân điện tử, buồng đếm hồng cầu - Dụng cụ phòng thí nghiệm
- Dụng cụ nuôi ong
- Cồn và các loại hóa chất khác. 3.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.1.3.1. Địa điểm nghiên cứu
- Trung Tâm Nghiên Cứu Ong - Ngõ 68 -Nguyên Hồng - Đống Đa - Hà nội - Các trại nuôi ong tại Nghệ An, Bắc Giang, Hoà Bình.
Tr−ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn Thạc sỹ khoa học nông nghiệp --- 20 3.1.3.2. Thời gian nghiên cứu
- Thời gian thực hiện đề tài từ 1/2007 đến tháng 6/2007
3.2. Nội dung nghiên cứu
− Điều tra tình hình nhiễm bệnh Nosema apis trên ong mật tại các trại nuôi
ong ở một số tỉnh của Việt Nam (Hòa Bình, Nghệ An, Bắc Giang.)
− Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học sinh thái của Nosema apis trên
ong ngoại Apis mellifera.
− Thử nghiệm một số biện pháp điều trị để tìm ra giải pháp phòng chống có
hiệu quả, an toàn nhất.
3.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Điều tra tình hình nhiễm bệnh Nosema apis ở một số tỉnh của Việt Nam Nam
3.3.1.1. Đặc điểm tự nhiên và tình hình nuôi ong ở các điểm điều tra
Thu thập thông tin về nguồn thức ăn (nguồn mật, nguồn phấn), thế đàn ong, qui mô trại ong, điều kiện nhiệt độ, ẩm dộ, l−ợng m−a...
3.3.1.2. Điều tra tình hình nhiễm bệnh Nosema apis
* Thu thập mẫu ong thợ
− Mẫu ong là những ong thợ tr−ởng thành đ7 đi làm của giống ong Apis
mellifera tại Bắc Giang, Hòa Bình, Nghệ An.
− Mỗi tỉnh bắt 03 trại ong, mỗi trại bắt ngẫu nhiên 06 đàn và mỗi đàn bắt
30 ong thợ trong lứa tuổi đi làm (bắt những ong thợ đi làm ở cửa tổ). Mẫu
ong thợ bắt đ−ợc cho ngâm bảo quản trong cồn 700.
Tr−ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn Thạc sỹ khoa học nông nghiệp --- 21
* Ph−ơng pháp xét nghiệm bào tử Nosema apis
− Chuẩn bị mẫu:
Mỗi đàn ong lấy ngẫu nhiên 10 ong thợ, mỗi con ong thợ chỉ rút ruột rồi cho ruột của cả 10 con vào cối sứ d7 nhỏ, nghiền nát. Dùng pipet hút 10ml dung dịch sinh lý cho vào cối và hoà tan đều mẫu đ7 nghiền. Hút 1ml dung dịch trên rồi nhỏ lên buồng đếm hồng cầu (nơi có các vạch kẻ ô vuông). [14]
ảnh 2.1. Buồng đếm hồng cầu
Tr−ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn Thạc sỹ khoa học nông nghiệp --- 22
− Cách đếm
+ Sử dụng buồng đếm hồng cầu, diện tích ô là 0,00025 mm3, đếm toàn
bộ số bào tử có trong khu vực chia ô. + Mỗi mẫu đếm 03 lần
− Tính số l−ợng bào tử trong mẫu [14]:
0,00025 x m 1000 x V x N Tbt = Trong đó:
Tbt: Tổng số bào tử trung bình có trên ong thợ
N: Số l−ợng bào tử TB/ô nhỏ (sau khi chia số l−ợng bào tử trung bình của 01 ô cho 16 ô nhỏ/ô to)
V: Thể tích pha lo7ng của dịch ruột ong
m: Số l−ợng ong thợ đem phân tích (th−ờng là 10 ong thợ)
− Đánh giá mức độ nhiễm bệnh
Số l−ợng bào tử trung bình chứa trong một ong thợ xét mẫu đ−ợc phân theo 5 mức bệnh ( Gross, K. P.; Ruttner, F., 1970) [53]:
Bảng 3.1. Phân cấp bệnh Nosema apis Mức độ
nhiễm bệnh Số l−ợng bào tử N. apis/ong thợ cấp bệnh Ký hiệu
Nhẹ <500.000 +
Trung bình 500.000-1.000.000 ++
Khá nặng 1.000.000 - 10.000.000 +++
Nặng 10.000.000 - 20.000.000 ++++
Tr−ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn Thạc sỹ khoa học nông nghiệp --- 23 3.3.1.3. Điều tra mức độ nhiễm bào tử Nosema apis trên các cấp ong và sản
phẩm trong đàn ong bị bệnh
- Điều tra mức độ nhiễm bào tử Nosema apis trên: ấu trùng, ong tr−ởng
thành (ong đực và ong thợ) và sự có mặt của bào tử trong mật ong, phấn hoa (hay l−ơng ong), sáp ong ở những đàn ong bị nhiễm bệnh ở mức độ khá nặng.
- Mỗi điểm điều tra chọn 10 đàn ong bị nhiễm bệnh ở mức độ khá nặng, lấy mỗi đàn một số mẫu sau:
+ 30 ấu trùng ong thợ + 30 ong thợ
+ 30 ong đực
+ 03 mẫu phấn (mỗi mẫu 10 gam) + 03 mẫu mật (mỗi mẫu 10 gam) + 3 mẫu sáp cầu (mỗi mẫu 10 gam)
3.3.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của Nosema apis
3.3.2.1. Chuẩn bị nguồn bào tử Nosema apis để tiến hành các thí nghiệm
Bào tử đ−ợc thu từ những mẫu ong bị bệnh, rút ruột sao cho còn nguyên vẹn, nghiền nát, hòa dịch ruột ong với n−ớc cất. Lọc sạch tạp bẩn dung dịch
trên và kiểm tra lại số l−ợng bào tử. Ly tâm dung dịch đến khi số l−ợng bàotử
đạt 10.000.000 bào tử /ml dung dịch. Sau đó bảo quản trong dung dịch
Dulbeco's Modified Eagle Medium ở điều kiện nhiệt độ 50C. Khi tiến hành thí
nghiệm cần lọc rửa lại và lấy theo l−ợng thích hợp.
3.3.2.2. Khả năng xâm nhiễm và phát triển của bào tử Nosema apis trên ong thợ tr−ởng thành
− Thí nghiệm lây nhiễm tiến hành trên cá thể ong thợ tr−ởng thành của
giống ong ngoại A. mellifera để xác định thời gian xâm nhiễm và số l−ợng bào
Tr−ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn Thạc sỹ khoa học nông nghiệp --- 24
ảnh 3.3. Lây nhiễm bệnh Nosema apis trong phòng
(Ng−ời chụp: Hồ Kim Anh)
− Bố trí thí nghiệm:
Bắt ngẫu nhiên 50 ong thợ ở tuổi đi làm (những ong thợ ở cửa tổ) trên đàn
không bị bệnh cho vào lồng nuôi (nuôi trong tủ định ôn ở nhiệt độ 330C, độ ẩm
50%). Thí nghiệm chia thành 4 công thức, mỗi công thức cho ăn syro đ−ờng có hoà lẫn với số l−ợng bào tử/ong thợ khác nhau (mỗi công thức 03 lồng):
+ Công thức 1: Syro đ−ờng hoà lẫn với 10.000 (104) bào tử/ong thợ.
+ Công thức 2: Syro đ−ờng hoà lẫn với 100.000 (105) bào tử/ong thợ.
+ Công thức 3: Syro đ−ờng hoà lẫn với 1.000.000 (106) bào tử/ong thợ.
+ Công thức 4: Chỉ cho ăn syro đ−ờng (Đối chứng).
− Xét nghiệm bào tử:
Định kỳ sau 12h, 24h, 48h, 3 ngày,...đến 20 ngày lấy mẫu xác định l−ợng bào tử. Mỗi lần lấy 3 ong thợ của 1 mẫu, rút ruột ong và xác định số l−ợng bào tử/ong.
Tr−ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn Thạc sỹ khoa học nông nghiệp --- 25 3.3.2.3. Khả năng xâm nhiễm và phát triển của bào tử Nosema apis trên đàn
ong
− Thí nghiệm lây nhiễm tiến hành trên đàn ong để xác định thời gian
xâm nhiễm và khả năng gây hại của Nosema apis.
− Bố trí thí nghiệm:
+ Thí nghiệm tiến hành trên những đàn ong không bị nhiễm bệnh
Nosema apis và có thế đàn đồng đều 6 cầu/đàn (tiến hành cân đối đồng đều thế đàn tr−ớc khi lây nhiễm 3 tuần).
+ Xác định số l−ợng ong thợ có trong đàn ong để định l−ợng số l−ợng
bào tử Nosema apis lây nhiễm cho mỗi công thức thí nghiệm. Do không thể
đếm toàn bộ số ong thợ có trong đàn nên chúng tôi sử dụng ph−ơng pháp gián tiếp, nguyên tắc của ph−ơng pháp là xác định trọng l−ơng toàn bộ số ong có trong đàn rồi xác định trọng l−ợng trung bình của 1 ong sống để từ đó xác định số l−ợng ong sống có trong đàn.
Cách xác định số l−ợng ong trong đàn (ph−ơng pháp gián tiếp): Cân trọng l−ợng toàn bộ cả đàn ong (ong, cầu ong, thùng ong) vào buổi tối (khi toàn bộ ong thợ đ7 đi làm về), rồi rũ ong để cân riêng cầu và thùng từ đó ta có thể tính đ−ợc trọng l−ợng của toàn bộ số ong tr−ởng thành của đàn ong. Cân trọng l−ợng 100 ong sống (để xác định trọng l−ợng trung bình của 1 ong sống) rồi từ đó xác định số l−ợng ong sống có trong đàn.
+ Sau khi xác định đ−ợc số l−ợng ong thợ trong đàn và xét nghiệm
không có bào tử Nosema apis thì tiến hành phân công thức thí nghiệm. Thí
nghiệm gồm 3 công thức, mỗi công thức chọn ngẫu nhiên 3 đàn, cho ăn syro đ−ờng có hoà lẫn với số l−ợng bào tử/ong thợ nh− sau:
* Công thức 1: Syro đ−ờng hoà lẫn với 100.000 (105) bào tử/ong.
* Công thức 2: Syro đ−ờng hoà lẫn với 1.000.000 (106) bào tử/ong.
Tr−ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn Thạc sỹ khoa học nông nghiệp --- 26
− Xét nghiệm bào tử:
Định kỳ sau 3, 5, 7, 10, 13, 17, 20 ngày bắt mỗi đàn 30 ong thợ để xác
định số l−ợng bào tử Nosema apis/ong thợ.
3.3.2.4. Nghiên cứu ảnh h−ởng của bệnh Nosema apis đến tuổi thọ của ong thợ
Bố trí 4 công thức thí nghiệm, mỗi công thức 3 đàn, các công thức có thế đàn đồng đều 4 cầu, đ−ợc chăm sóc và quản lý nh− nhau. Kiểm tra đánh giá mức độ nhiễm bệnh của mỗi công thức rồi tiến hành lây nhiễm bệnh theo các cấp để cho mỗi công thức bị nhiễm bệnh theo các mức độ nh− sau:
Công thức 1: Đàn ong bị nhiễm bệnh Nosema apis ở mức nhẹ
Công thức 2: Đàn ong bị nhiễm bệnh Nosema apis ở mức trung bình
Công thức 3: Đàn ong bị nhiễm bệnh Nosema apis ở mức nặng
Công thức 4: Đối chứng: đàn ong không mắc bệnh
Sau khi đ7 lây nhiễm đ−ợc đúng cấp độ bệnh theo các công thức thì tiến hành đánh dấu ong thợ với các màu sắc khác nhau, mỗi đàn đánh dấu 50 con, cứ sau 3 ngày định kỳ kiểm tra 1 lần, kiểm tra trong vòng 60 ngày.
- Tính tuổi thọ của ong [4]:
T
Tuổi thọ = L
Trong đó:
- T: Tổng số ngày ong thợ sống đ−ợc từ khi nở đến khi không còn con nào sống trong tập hợp sinh ban đầu.
Tr−ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn Thạc sỹ khoa học nông nghiệp --- 27
ảnh 3.4. Theo dõi tuổi thọ của ong thợ
(Ng−ời chụp: Hồ Kim Anh)
3.3.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh thái của Nosema apis
3.3.3.1. ảnh h−ởng của nhiệt độ tới sự phát triển của Nosema apis
− Thí nghiệm tiến hành trên cá thể ong thợ tr−ởng thành để xác định
khả năng phát triển của bào tử Nossema apis ở 03 ng−ỡng nhiệt độ: 25-280C;
30-350C và 35- 400C.
− Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 3 công thức theo 3 ng−ỡng nhiệt
độ, mỗi công thức lặp lại 3 lần, ở mỗi lần lặp có 3 lồng, mỗi lồng 50 ong thợ (ong thợ đ−ợc bắt ngẫu nhiên trên 1 đàn sạch bệnh). Ong thợ ở tất cả các công
thức đều đ−ợc cho ăn syro đ−ờng có lẫn bào tử với số l−ợng 105 bào tử/ong
thợ. Thí nghiệm tiến hành trên 3 tủ định ôn khác nhau, làm cùng thời điểm và đều ở ẩm độ 50%.
Tr−ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn Thạc sỹ khoa học nông nghiệp --- 28
+ Công thức 1: Nuôi ở ng−ỡng nhiệt độ 250C - 280C .
+ Công thức 2: Nuôi ở ng−ỡng nhiệt độ 300C - 350C.
+ Công thức 3: Nuôi ở ng−ỡng nhiệt độ 350C - 400C.
− Xét nghiệm bào tử: Định kỳ sau 3, 5, 7, 10, 13, 17, 20 ngày, mỗi lần
xét nghiệm 3 ong thợ/mẫu.
3.3.3.2. ảnh h−ởng của tuổi ong thợ đến mức độ nhiễm bệnh Nosema apis
− Thí nghiệm đ−ợc tiến hành trên các lứa tuổi khác nhau của ong thợ
tr−ởng thành thuộc giống ong A. mellifera. Các lứa tuổi thí nghiệm là: 1-2
ngày tuổi (mới nở), 3-5 ngày tuổi, 8-12 ngày tuổi và ong thợ đi làm (18-20 ngày tuổi).
− Bố trí thí nghiệm:
+ Xác định tuổi ong thợ tr−ởng thành: Cầu nhộng ong thợ sắp nở đ−ợc đ−a vào tủ định ôn để khi ong thợ nở ra đánh dấu xác định ngày tuổi rồi thả trở lại đàn sạch bệnh. Đánh dấu tr−ớc khi tiến hành thí nghiệm 20 ngày để có các loại lứa tuổi nh− trên.
+ Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm chia thành 4 công thức, mỗi công thức 3 lồng, mỗi lồng 30 ong thợ theo các công thức thí nghiệm nh− sau:
* Công thức 1: Ong thợ tr−ởng thành từ 1-2 ngày tuổi. * Công thức 2: Ong thợ tr−ởng thành từ 3-5 ngày tuổi. * Công thức 3: Ong thợ tr−ởng thành từ 8-12 ngày tuổi. * Công thức 4: Ong thợ tr−ởng thành từ 18-20 ngày tuổi.
Các công thức đều nuôi trong tủ định ôn ở nhiệt độ 33,50C, độ ẩm 50%
và cho ăn syro đ−ờng trộn lẫn l−ợng bào tử là 105 bào tử/ong thợ. Thí nghiệm
lặp lại 3 lần.
− Xét nghiệm bào tử:
Sau 7 ngày lây nhiễm bắt mẫu ong kiểm tra số l−ợng bào tử trên ong ở các công thức thí nghiệm.
Tr−ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn Thạc sỹ khoa học nông nghiệp --- 29
3.3.4. Thử nghiệm một số loại axít hữu cơ phòng trị bệnh Nosema apis
3.3.4.1. Thí nghiệm trên cá thể ong thợ
− Các loại axít hữu cơ sử dụng: Axit Lactic (C3H6O3), Axit Acetic
(C2H4O2, CH3COOH), Axit Oxalic [C2H2O4, (COOH) 2].
− Bố trí thí nghiệm:
Chọn đàn ong khỏe, sạch bệnh, bắt ong thợ ở lứa tuổi đi làm (khoảng 600
con), cho vào nuôi trong tủ ấm và cho ăn bào tử với l−ợng 105 bào tử/ong thợ.
Sau 3 ngày xét nghiệm lại l−ợng bào tử (để có số l−ợng bào tử đồng đều tr−ớc điều trị) rồi chia đều số ong thợ ra các lồng (mỗi lồng 50 con).
Bố trí 9 công thức thí nghiệm và 1 đối chứng (10 công thức), mỗi công thức lặp lại 3 lần (3 lồng):
+ Công thức1: Syro đ−ờng trộn lẫn axít Acetic, nồng độ axít 0,5%
+ Công thức 2: Syro đ−ờng trộn lẫn axít Acetic, nồng độ axít 0,85% + Công thức 3: Syro đ−ờng trộn lẫn axít Acetic, nồng độ axít 1% + Công thức 4: Syro đ−ờng trộn lẫn axít Lactic: Nồng độ axít 0,3% + Công thức 5: Syro đ−ờng trộn lẫn axít Lactic: Nồng độ axít 0,4% + Công thức 6: Syro đ−ờng trộn lẫn axít Lactic: Nồng độ axít 0,5% + Công thức 7: Syro đ−ờng trộn lẫn axít Oxalic: Nồng độ axít 0,1% + Công thức 8: Syro đ−ờng trộn lẫn axít Oxalic: Nồng độ axít 0,2% + Công thức 9: Syro đ−ờng trộn lẫn axít Oxalic: Nồng độ axít 0,3% + Công thức 10: Đối chứng
− Xét nghiệm bào tử: Sau khi cho ăn thuốc và bào tử 20 ngày bắt ong để
Tr−ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn Thạc sỹ khoa học nông nghiệp --- 30
− Hiệu quả điều trị (%): Tính theo công thức Abbott [6]:
Trong đó:
C: Số l−ợng bào tử/ong thợ của công thức đối chứng sau khi xử lý. T: Số l−ợng bào tử/ong thợ của công thức thí nghiệm sau khi xử lý.
3.3.4.2. Thí nghiệm trên đàn ong
− Các loại thuốc, axít hữu cơ sử dụng:
+ Thuốc kháng sinh Fumagillin (tên th−ơng phẩm là Fumidil-B): Đây là