dương tớnh, õm tớnh vào phần ký hiệu mẫu (sample identification) trong bảng kết quả. Lưu chương trỡnh chạy mỏỵ
Bảng 3. Lượng chất phản ứng Real-time RT-PCR dựng cho cỏc cặp mồi phỏt hiện gen MA (Cỳm A), H5.
Liều lượng cho 1 PƯ Hàm lượng cuối cựng
H2O 6,95 àl
5X buffer 5 1X
25mM MgCl2 1,25 3,75 mM*
dNTP's (10mM mỗi loại) 0,8 320 mM mỗi loại dNTP Mồi chạy xuụi (20 pmol/ml) 0,5 10 pmol/25 àl
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………105 RNase Inhibitor (13,3 units/ml) 0,5 0,266 units/àl
Enzyme Mix 1,0
Mẫu dũ (6 pmol/ml) 0,5 0,12 àM
Tổng lượng cho 1 phản ứng 17 àl
Mẫu ARN 8 àl
Lượng toàn bộ trong ống mẫu 25 àl
* Quiagen buffer ủó cú sẵn MgCl2 2,5mM ở hàm lượng 1X
+ Cài ủặt chương trỡnh phõn tớch dữ liệu cho mỏy chu kỳ nhiệt Cepheidđ Smart Cycler.
Phần mềm Smart Cycler cung cấp nhiều phương phỏp xỏc ủịnh ngưỡng chu kỳ (Ct). Tất cả cỏc cỏch phõn tớch dữ liệu ủược lấy từ Analysis Settings
trong View Results. Những thay ủổi trong cài ủặt mặc ủịnh tiờu chuẩn ủó
ủược thiết lập ủối với cỏc phõn tớch phỏt hiện vi rỳt Cỳm A với cỏc cặp mồi Matrix, H5.
+ Phõn tớch kết quả xột nghiệm
ðộủặc hiệu của cỏc phương phỏp xột nghiệm matrix, H5
Phương phỏp xột nghiệm matrix vi rỳt Cỳm gia cầm (AIV) ủược dựng phỏt hiện tất cả cỏc phõn nhúm của AIV. Ngược lại phương phỏp ủặc hiệu xỏc
ủịnh phõn nhúm H5, dựng giỏm ủịnh AIV H5. Phương phỏp xột nghiệm H5
ủó cho thấy khả năng phỏt hiện AIV H5N1 chủng Asian (Chõu Á). Vỡ phương phỏp xột nghiệm matrix nhạy hơn (khoảng 10 lần) H5 nờn thường dựng test này ủể kiểm tra tất cả cỏc mẫụ Mẫu dương tớnh với matrix và cả H5 sẽ cho phộp khẳng ủịnh mẫu chứa ARN của AIV. Tuy nhiờn mẫu dương tớnh với matrix bằng kỹ thuật RRT-PCR mà õm tớnh với H5 thỡ cú thể vẫn chứa ARN của phõn nhúm H5, nhưng do số lượng ARN thấp hơn khả năng phỏt hiện của kỹ thuật xột nghiệm này hoặc cú phõn nhúm khỏc ngoài H5 ủang gõy bệnh. Những mẫu bệnh phẩm này ủược xem là mẫu nghi ngờ.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………106 Phương phỏp xột nghiệm matrix, H5, cũng cú thể phỏt hiện cỏc mẫu bệnh phẩm dương tớnh giả. Những mẫu cú Ct bằng 35 hoặc lớn hơn ủược xem là dương tớnh nghi ngờ và ủược xột nghiệm lại bằng RRT-PCR
Tất cả mẫu bệnh phẩm nghi ngờ và mẫu chỉ cho dương tớnh matrix với kỹ thuật RRT-PCR cần ủược xỏc chẩn bằng phương phỏp phõn lập vi rỳt trước khi thụng bỏo kết quả dương tớnh. Tất cả cỏc mẫu chưa chắc chắn thỡ phải xột nghiệm lạị
Giỏ trị Ct của ủối chứng dương tớnh ARN ủược sao mó
ðối chứng dương tớnh ARN ủó sao mó ủược pha loóng ở hàm lượng sử
dụng cho giỏ trị Ct khoảng 25. Khi ủối chứng cú Ct cao hơn 29 thỡ phải làm lại
ủể xột nghiệm ủảm bảọ Nếu Ct của ủối chứng dương tớnh thấp hơn 20, nờn chuẩn ủộ lại ủộ pha loóng của ủối chứng. Bất kỳ thời ủiểm nào Ct của ủối chứng dương tớnh hoặc ủường cong tăng trưởng khỏc thấp hơn 14, giỏ trị trừ
nền cú thể bị sai lệch.
Hướng dẫn ủỏnh giỏ ủồ thị huỳnh quang (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Giỏm ủịnh cỏc mẫu dương tớnh yếụ
Loại bỏ tất cả phản ứng lớn hơn 100 ủơn vị tăng huỳnh quang từ trong
ủồ thị (ủiều này làm thay ủổi thước ủo ủể dễ xỏc ủịnh cỏc trường hợp dương tớnh yếu). Quan sỏt riờng từng mẫu sẽ giỳp xỏc ủịnh cỏc phản ứng dương tớnh yếu
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………107
ðồ thị huỳnh quang của cỏc mẫu chạy trờn mỏy Smart Cycler. Giỏ trị
trừ nền ủược bật. Tất cả cỏc tiờu chớ phõn tớch ủó ủược cài ủặt giỏ trị mặc ủịnh thớch hợp. Chỳ ý thước ủo từ 0 ủến 1000 ủơn vị huỳnh quang (trục Y) khú xỏc ủịnh ủược cỏc mẫu dương tớnh yếụ
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………108
Bảo quản vắc xin 2 - 80C
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………109
Dụng cụ và nguyờn liệu làm phản ứng HA, HI
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………110
Tiờu bản chuẩn ủộ 4HA