Khỏng nguyờn ủể tan ở nhiệt ủộ phũng .
Chuẩn ủộ hiệu giỏ khỏng nguyờn bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu vi lượng (HA).
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………99
Cho 50àl khỏng nguyờn vào giếng 1, dựng pipet trộn ủều hỳt 50àl sang giếng thứ 2, trộn ủều, làm tương tự ủến giếng thứ 11. Ta cú khỏng nguyờn pha loóng bậc 2. Giếng thứ 12 dựng làm ủối chứng hồng cầu
Cho vào tất cả cỏc giếng 50àl hồng cầu gà 0,5%, lắc nhẹ ủĩa, ủể
nhiệt ủộ phũng trong 30 phỳt, ủọc kết quả.
Hiệu giỏ khỏng nguyờn tớnh ủến ủộ pha loóng cuối cựng cũn khả năng làm ngưng kết hồng cầu gọi là 1 ủơn vị HA
Trong phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu dựng khỏng nguyờn 4
ủơn vị (4 ủơn vị HA) pha trong dung dịch pha loóng khỏng nguyờn
- Tiến hành phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu vi lượng (HI)
Cho 25àl NaCl 0,85% từ giếng A ủến giếng G
Cho 50àl NaCl 0,85% vào cỏc giếng ở hàng H
Cho 25àl huyết thanh ủó xử lý vào giếng Ạ Dựng pipet trộn ủều và hỳt 25àl từ giếng A ủến giếng G (giữ lại 25àl ở hàng G) ta cú huyết thanh pha loóng bậc 2. Hàng G dựng làm ủối chứng huyết thanh.
Cho 25àl khỏng nguyờn 4 ủơn vị HA vào cỏc giếng trừ cỏc giếng ở
hàng G và H, lắc ủể nhiệt ủộ phũng 30 phỳt
Cho 25àl hồng cầu 1%, lắc ủều ủể nhiệt ủộ phũng 30 phỳt
ðọc kết quả.
o Nhận ủịnh kết quả:
Huyết thanh cú khỏng thể khỏng vi rỳt cỳm khi cú hiện tượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (hồng cầu tụ lại dưới ủỏy giếng).
Hiệu giỏ khỏng thể là ủộ pha loóng cao nhất của huyết thanh cũn cú khả năng ngăn trở ngưng kết hồng cầu hoàn toàn.
4. Phương phỏp làm phản ứng Real-time RT – PCR (RRT – PCR)
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………100 - Ống 25 ml Smart Cyclerđ (catalog @900-0022 hoặc 900-0003, Cepheidđ Smart Cycler, Sunnyvale, CA)
- Giỏ ống phản ứng PCR làm lạnh và mỏy li tõm ống nhỏ. Cả 2 thiết bị
này ủược cung cấp kốm theo hệ thống mỏy Smart Cyclerđ
- Hệ thống bơm hỳt chõn khụng 24 van QiaVacđ cú khả năng hỳt 18-20 lớt/phỳt.
* Nguyờn liệu
- Nước cất vụ trựng (Rnase-free)
- RNA ủối chứng dương tớnh M, H5 và H7 (ủược NVSL cung cấp) - Cồn tuyệt ủốị
- Isopropanol, 99+% tinh khiết. - Chloroform, 99+% tinh khiết.
- Trizolđ LS reagent (Invitrogen, cat @10296-010 hoặc 10296-028). - Kớt chiết tỏch Qiagenđ Rneasy Extraction (cat @ 74104 50 prep hoặc @74106 250 prep).
- Kit RT-PCR 1 bước Qiagenđ (cat @ 210210 hoặc 210212) hoặcSuperscriptđ RT-PCR One-Step RT-PCR với Platinium Taq DNA Polymerase (cat @10928-034 hoặc 10928-042, Invitrogenđ). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Mẫu dũ và primer
Cú thểủặt primer và mẫu dũ: Integrated DNA Technologies, hoặc Operon.
* Thực hiện phản ứng
Trước khi làm RRT-PCR, ủặt cỏc pipet, khay, ủầu pipet,... vào buồng vụ trựng sạch. Tương tự, ủặt cỏc dụng cụ làm mẫu vào buồng vụ trựng khỏc. Bật
ủốn tử ngoại trong nhiều giờ hoặc qua ủờm ủể giảm tạp nhiễm ARN từ pipet và cỏc dụng cụ khỏc.
+ Chiết tỏch ARN từ mẫu dịch ngoỏy (Phương phỏp Qiagenđ
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………101 - Lắc mạnh (bằng mỏy Votex) ống chứa dịch ngoỏy và chuyển lượng 500àl sang ống ly tõm nhỏ và ghi ký hiệu mẫụ
-Cho 500àl Qiagenđ buffer RLT cú β-ME vào ống ly tõm trờn. Lắc ủều trờn mỏy Votex.
- Ly tõm (bằng mỏy Spindown) ủể dịch bệnh phẩm ủọng trờn nắp trụi xuống ủỏy ống. Cho 500àl cồn ETOH 70% (ethanol), lắc mạnh bằng Votex. Ly tõm mẫu ủó bị dung giải trong 5 phỳt ở tốc ủộ 5000xg ở nhiệt ủộ phũng.
- Chuyển tất cả dịch nổi chứa mẫu bị dung giải sang cột RNeasyđ Qiagen ủó ghi sẵn ký hiệu mẫụ Ly tõm trong 15 giõy tốc ủộ 8000xg ở nhiệt
ủộ phũng. Kiểm tra dịch mẫu ủó thấm qua cột lọc chưạ Lặp lại bước này cho
ủến khi toàn bộ mẫu ủó qua cột lọc.
- Bổ sung 700àl dung dịch rửa1 (RW1 buffer) vào cột RNeasyđ Qiagen, ly tõm trong 15 giõy ở tốc ủộ 8000xg, thay ống thu mẫu mới (collection tube) vào cột lọc.
- Cho 500àl RPE buffer vào cột RNeasyđ và ly tõm trong 15 giõy ở tốc
ủộ≥8000xg, thay ống thu mẫu mới vào cột lọc.
- Lặp lại bước trờn 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer. Sau lần rửa cuối cựng thay ống thu mẫu mới loại 2 ml vào cột lọc.
- Ly tõm cột lọc trống khụng trong 2 phỳt ở tốc ủộ tối ủa (khoảng 12.000 vũng/phỳt), bỏống thu mẫụ
- ðặt cột lọc vào ống thu hoạch hoặc ống 1,5 ml ủó ủược ghi sẵn ký hiệu mẫụ Cho 50 àl RNase free H2O vào cột lọc. Chỳ ý khụng ủược chạm
ủầu pipet vào mặt thạch Silica trong cột lọc. ủở nhiệt ủộ phũng trong ớt nhất 1 phỳt. Tỏch ARN bằng cỏch ly tõm cột trong 1 phỳt ở 10.000vũng/phỳt. Bỏ cột lọc RNeasyđ.
- Bảo quản mẫu ARN thu ủược ở 40C trong thời gian ngắn trước khi làm RRT-PCR, nếu sau 24 giờ, mẫu nờn bảo quản ở -200C hoặc nhiệt ủộ thấp hơn.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………102
+ Chiết tỏch mẫu tổ chức bằng TrizolđLS:
- Cho 0,75 ml Trizolđ LS reagent (hoặc 1 ml Trizolđ reagent) + 0,25 ml dịch bệnh phẩm (0,1 ml dịch bệnh phẩm nếu dựng Trizolđ reagent) vào
ống 1,5 ml. Lắc ủều và ủểở nhiệt ủộ phũng 5 phỳt.
- Thờm 0.2 ml chloroform vào mỗi ống. Lắc mạnh trong 15 giõy và ủểở
nhiệt ủộ phũng 5 phỳt.
- Ly tõm ống ở tốc ủộ 12.000 g trong 15 phỳt ở 4°C.
- Chuyển phần nước (khoảng 500 àl) sang ống microtube mớị
- Thờm 0.5 ml Isopropanol và lắc ủềụ ðể 5-10 phỳt ở nhiệt ủộ phũng. - Ly tõm ống ở tốc ủộ 10.000 g trong 5 phỳt ở 4°C. Bỏ dung dịch trong
ống ủị (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Rửa RNA ủúng ở ủỏy ống bằng cồn 80%, lắc mạnh và ly tõm với tốc
ủộ 10.000 g trong 5 phỳt ở 4°C.
- Bỏ dung dịch trong ống và làm khụ RNA 10 phỳt ở nhiệt ủộ phũng và hoà tan lại với 30 àl nước cất khụng cú Rnase hoặc nước cất ủó xử lý DEPC.
+ Sao mó ngược và PCR
Cú 2 khu vực tiến hành xột nghiệm trong quy trỡnh này:
Một là khu vực “sạch” gồm cú buồng cấy vụ trựng (BSC), tủ õm cựng cỏc dụng cụ và khu vực nhõn gen (thermal cycling area). (Khụng ủược ủể cỏc chất cú ARN/ADN vào khu vực “sạch” và phải luụn thay găng tay trước khi vào khu vực “sạch”).