3. Nội dung nguyên liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.3.3. Phản ứng HI
3.3.3.1. Nguyên liệu
+ Kháng nguyên chuẩn: Inactivated antigen H5N1 (Veterinary Laboratories Agency).
Kháng nguyên là virus cúm subtype H5 đ−ợc tiêm truyền vào xoang niệu mô của trứng gà có phôi. N−ớc trứng thu hoạch đ−ợc vô hoạt bởi β
propiolacton. Pha kháng nguyên H5 cho phản ứng HI là 8 đơn vị HA/50àl.
+ Hồng cầu: Hỗn dịch hồng cầu 0,5% đ−ợc chuẩn bị từ hồng cầu gà trống tr−ởng thành.
kháng virus cúm và kháng virus newcastle, đ−ợc lấy máu ở tĩnh mạch cánh bằng seringer 5 ml có chứa 1 ml Natri citrat 5%.
Rửa hồng cầu: Cho PBS (pH 7,2) vào ống ly tâm chứa hồng cầu lắc nhẹ. Ly tâm 1000 - 1500 vòng/phút trong 10 phút. Đổ bỏ huyết t−ơng ở trên, rửa hồng cầu tiếp 2 -3 lần bằng PBS đến khi dung dịch ở phía trên trong là đ−ợc.
Pha hồng cầu 0,5%: Bỏ n−ớc trong ở trên, lấy 0,5 ml hồng cầu cho vào 99,5 ml PBS lắc đều. Bảo quản ở 40C, dùng đ−ợc trong 4 - 5 ngày.
+ Huyết thanh: Huyết thanh làm phản ứng đ−ợc chắt từ mẫu máu, bảo quản ở 4-80C.
3.3.3.2. Phản ứng ng−ng kết hồng cầu (HA)
Phản ứng HA dùng để chuẩn độ kháng nguyên chuẩn H5 và kháng nguyên (là virus) phân lập từ bệnh phẩm. Dùng đĩa làm phản ứng ng−ng kết đáy chữ V gồm 12 cột và 8 hàng.
Tiến hành phản ứng:
- Cho 50 àl PBS (pH 7,2) vào tất cả các giếng.
- Cho 100àl kháng nguyên chuẩn hoặc kháng nguyên phân lập vào các giếng từ A1 ặ H1.
- Pha loãng bậc 2 kháng nguyên kiểm tra. Chuyển 50 àl từ giếng 1 đến giếng 11 rồi bỏ đi 50 àl.
- Cột 12 dùng đối chứng chỉ chứa: 50àl PBS và 50 àl hồng cầu gà 0,5%. - Cho 50 àl hồng cầu gà 0,5% vào các giếng phản ứng.
- Lắc nhẹ bằng tay hoặc bằng máy. Để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Đọc kết quả.
Đọc kết quả:
- Phản ứng (-) : Hồng cầu lắng đều ở d−ới đáy
- Phản ứng (+): Xảy ra hiện t−ợng ng−ng kết: Hồng cầu ng−ng kết thành cụm lấm tấm xung quanh giếng.
- Đọc hiệu giá ng−ng kết: Hiệu giá ng−ng kết kháng nguyên đ−ợc đánh giá ở độ pha loãng cao nhất còn có phản ứng ng−ng kết xảy ra.
3.3.3.3. Phản ứng HI
Dùng đĩa ng−ng kết 96 giếng, đáy chữ V.
Tiến hành phản ứng:
- Ghi mẫu huyết thanh cần kiểm tra lên đĩa ng−ng kết. - Cho 25 àl PBS vào tất cả các giếng trên đĩa.
- Cho 50 àl huyết thanh kiểm tra vào các giếng từ A1 ặ H1 (cột 1) - Pha loãng huyết thanh: Lấy 25 ml huyết thanh từ cột 1 chuyển sang cột 2 trộn đều với PBS của giếng, sau đó lại chuyển 25 àl từ cột 2 sang cột 3 cứ nh− vậy huyết thanh đ−ợc pha loãng đến cột 11 thì hút bỏ đi 25 àl huyết thanh. Cột 12 dùng để đối chứng.
- Cho kháng nguyên 8 đơn vị HA đã pha loãng ở trên vào các giếng có mẫu kiểm tra với l−ợng 25 àl. Nh− vậy kháng nguyên đ−ợc đ−a vào phản ứng HI là 4 đơn vị HA (8 đơn vị HA/50 àl, khi đ−a vào phản ứng là 4 đơn vị HA/25 àl).
- Lắc đều ở nhiệt độ phòng 30 phút.
- Cho 50 àl hồng cầu gà 0,5% đã lắc đều vào các giếng phản ứng. Để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Đọc kết quả khi cột đối chứng hồng cầu lắng hoàn toàn.
Đọc kết quả:
- Có kháng thể (+): Hồng cầu sẽ tụ ở đáy giếng giống đối chứng hồng cầu. Hiệu giá kháng thể đ−ợc đánh giá ở độ pha loãng huyết thanh cao nhất còn có hiện t−ợng hồng cầu tụ lại ở đáy giếng.
- Không có kháng thể (-): Có hiện t−ợng ng−ng kết xảy ra ở giếng phản ứng.