2. Tổng quan tài liệu
2.6.1. Chẩn đoán huyết thanh học
Phản ứng huyết thanh học dùng để nhận biết các kháng thể có từ 7 - 10 ngày sau khi chủng vaccine. Chúng ta có thể sử dụng các ph−ơng pháp chẩn đoán nh− phản ứng ng−ng kết hồng cầu -HA (Hemagglutination test), phản ứng ngăn trở ng−ng kết hồng cầu - HI (Hemagglutination inhibition test)
Phản ứng ngăn trở ng−ng kết hồng cầu- HI:
Phản ứng này đ−ợc ứng dụng để:
- Chẩn đoán bệnh cúm gia cầm: xác định type hoặc subtype của chủng virus Cúm phân lập với các kháng thể đặc hiệu đã biết (mẫu kiểm tra là n−ớc
trứng hoặc môi tr−ờng tế bào thu hoạch sau khi tiêm truyền bệnh phẩm). - Phát hiện kháng thể cúm gia cầm với subtype của chủng virus Cúm bị nhiễm hoặc sau khi sử dụng vaccine phòng bệnh (mẫu kiểm tra là huyết thanh).
2.6.2. Chẩn đoán virus học
Phân lập virus và xác định virus cúm gia cầm typ A là hết sức cần thiết và bắt buộc trong chẩn đoán bệnh [14].
* Phân lập virus bằng tiêm truyền trên phôi trứng.
Ph−ơng pháp phân lập virus thích hợp là tiêm truyền qua phôi trứng gà hoặc tế bào nuôi cấy.
Tiêm 0,1 - 0,3ml n−ớc bệnh phẩm vào túi niệu của phôi gà 9 - 11 ngày tuổi, hàn kín và tiếp tục cho ấp ở nhiệt độ 370C trong 2 - 3 ngày.
Một số ít chủng virus có độc lực cao có thể gây chết phôi khoảng 18-24 giờ, trứng thu hoạch để ở nhiệt độ 40C qua một đêm. Virus nhân lên trong n−ớc trứng có hiện t−ợng ng−ng kết hồng cầu gà. Nếu không gây ng−ng kết hồng cầu thì có thể lấy n−ớc trứng thu đ−ợc tiêm lần 2 cho phôi gà.Phần lớn các phôi bị tạp khuẩn sẽ chết tr−ớc 24 giờ phải bỏ đi. Những phôi sống sau 24h tiếp tục đ−ợc theo dõi đến 72h.
Lấy n−ớc phôi từ những phôi chết trong khoảng 48h và sau 48h hoặc từ phôi ch−a chết đến 72h vào việc giám định virus. Đây là khoảng thời gian mà số l−ợng virus cúm (nếu có) đã đạt đến mức lý t−ởng.
* Giám định virus bằng ph−ơng pháp nhân gen phiên m∙ ng−ợc RT-PCR.
Dùng để xác định đ−ợc Subtyp H và N.
Phản ứng RT - PCR: Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một kỹ thuật tiên tiến để giám định hệ gen của virus Cúm thậm chí khi chúng chỉ có mặt với một l−ợng rất thấp. Do hệ gen của virus Cúm là chuỗi xoắn đơn RNA, nên cần phải tổng hợp một bản sao DNA (cDNA) bổ sung với RNA của virus tr−ớc khi tiến hành nhân PCR. Men Reverse Transcriptase là một polymerase
đ−ợc dùng để tổng hợp nên cDNA nh− vậy. Do đó quá trình nhân hệ gen RNA của virus Cúm đ−ợc gọi là RT- PCR. Phản ứng RT-PCR cần có một cặp oligonucleotides, hoặc còn gọi là primer (cặp mồi); 4 deoxyribonucleoside triphosphate (dNTPs); RNA khuôn mẫu, men Rt và Taq DNA polymerase. Hỗn hợp phản ứng tr−ớc tiên đ−ợc làm nóng tới 600C, sau đó làm mát tới nhiệt độ 420C để primer forward (tiến về tr−ớc) gắn vào chuỗi RNA đích. Primer đã gắn sau đó đ−ợc kéo dài ra với RT để tổng hợp cDNA có độ dài đầy đủ ở nhiệt độ 500C. Hỗn hợp DNA/RNA sẽ trải qua 25 - 30 vòng gồm các giai đoạn tách sợi, gắn vào và kéo dài. Men Taq DNA là một loại men polymerase bền nhiệt không bị phá huỷ bởi nhiệt độ nóng và không cần phải thay thế ở mỗi vòng của chu trình nhân lên. Do sản phẩm của mỗi 1 vòng nhân lên sẽ làm khuôn mẫu cho vòng tiếp theo, nên mỗi vòng sẽ nhân đôi số sản phẩm DNA mong muốn.
Cặp primer đ−ợc sử dụng trong phản ứng PCR đ−ợc thiết kế dựa trên cơ sở của chuỗi gen đã biết. Do các chuỗi HA của các type/ subtype của các vi- rút Cúm khác nhau cũng khác nhau nên có thể thiết kế các primer PCR để nhân lên một cách đặc hiệu của RNA của một type hoặc subtype.
Mẫu bệnh phẩm : là dịch ổ nhớp, phân, hoặc mẫu bệnh phẩm phân lập từ trứng hoặc môi tr−ờng tế bào.
3. Nội dung - nguyên liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1. Nội dung
3.1.1. Kiểm nghiệm vaccine cúm gia cầm ngoại nhập
- Đánh giá chỉ tiêu thuần khiết của vaccine cúm gia cầm H5N2 nhập từ Hà Lan và vaccine cúm gia cầm H5N2 nhập từ Trung Quốc.
- Đánh giá chỉ tiêu an toàn của vaccine cúm gia cầm H5N2 ngoại nhập trên gà.
- Đánh giá chỉ tiêu hiệu lực của vaccine cúm gia cầm H5N2 trên gà.
3.1.2. Khảo nghiệm vaccine cúm gia cầm H5N2 ngoại nhập
- Khảo sát ảnh h−ởng của vaccine cúm gia cầm H5N2 ngoại nhập ở đàn gà đẻ trứng th−ơng phẩm qua các chỉ tiêu: trọng l−ợng gà, tỷ lệ đẻ, tỷ lệ chết của đàn gà đ−ợc tiêm vaccine.
- Giám sát sự l−u hành của virus cúm H5N1 trên đàn gà khảo nghiệm vaccine cúm gia cầm vô hoạt H5N2.
- Khảo sát diễn biến của hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên cúm H5 của đàn gà đ−ợc tiêm vaccine.
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch kháng kháng nguyên cúm H5 của đàn gà tại các thời điểm 0, 3, 4, 6, 8, 14, 16 tuần sau khi tiêm vaccine lần thứ nhất.
3.2. Nguyên liệu
3.2.1. Động vật thí nghiệm
+ Gà 4 tuần tuổi.
+ Gà h−ớng trứng 15 tuần tuổi. + Thức ăn đã đ−ợc tiêu chuẩn hoá.
3.2.2. Vaccine
Vaccine vô hoạt chống bệnh cúm gia cầm chủng H5N2 của Hà Lan và của Trung Quốc.
- Vaccine của Hà Lan: Vaccine Nobilis Influenza H5N2 dạng nhũ dầu. Đây là vaccine chứa kháng nguyên vô hoạt virus cúm gia cầm độc lực thấp chủng Mexico, subtype H5N2.
- Vaccine của Trung quốc: Vaccine H5N2 dạng nhũ dầu màu trắng sữa. Đây là vaccine chứa kháng nguyên vô hoạt cúm gia cầm subtype H5N2 (theo ký hiệu của nhà sản xuất: H5N28): A/ gà tây/ Anh/N28/73.
3.2.3. Các trang thiết bị và cơ sở vật chất
Các trang thiết bị và cơ sở vật chất của các phòng thí nghiệm thuộc Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc Thú y Trung −ơng I, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung −ơng.
3.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Kiểm nghiệm vaccine
Vaccine đ−ợc kiểm nghiệm để đánh giá các chỉ tiêu thuần khiết, an toàn và hiệu lực tại Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc Thú y Trung −ơng I [4], so sánh với hồ sơ kỹ thuật của các nhà sản xuất [25].
3.3.1.1. Chỉ tiêu thuần khiết
Vaccine cúm gia cầm của Trung Quốc và vaccine cúm gia cầm của Hà Lan đ−ợc kiểm tra trên các môi tr−ờng cơ bản: n−ớc thịt, n−ớc thịt gan yếm khí, thạch th−ờng và thạch nấm, mỗi loại 2 ống. Sau khi cấy, các môi tr−ờng đ−ợc bồi d−ỡng ở nhiệt độ 370C, riêng thạch nấm để ở nhiệt độ phòng (25- 300C). Môi tr−ờng đã cấy kiểm tra đ−ợc theo dõi trong 7 ngày, sau đó đọc kết quả.
3.3.1.2. Chỉ tiêu an toàn
tôi dùng 20 gà 4 tuần tuổi, giống ISA Brown nuôi chung với nhau và chia làm 2 nhóm:
*Nhóm gà kiểm tra an toàn: 10 gà đ−ợc tiêm vaccine vào bắp ức, mỗi gà 2 ml vaccine (4 liều/con).
*Nhóm gà đối chứng: 10 gà đối chứng không đ−ợc tiêm vaccine. Gà đ−ợc nuôi d−ỡng trong điều kiện thí nghiệm, đ−ợc theo dõi trong 28 ngày về diễn biến sức khoẻ, tình hình bệnh và các triệu chứng lâm sàng.
+ Vaccine cúm gia cầm Hà Lan: 20 gà 4 tuần tuổi, giống ISA Brown đ−ợc nuôi chung với nhau và chia làm 2 nhóm:
*Nhóm gà an toàn: 10 gà đ−ợc tiêm vaccine vào d−ới da cổ, mỗi gà 1,5 ml (3 liều/con).
* Nhóm gà đối chứng: 10 gà đối chứng không đ−ợc tiêm vaccine. Các nhóm gà đ−ợc nuôi d−ỡng trong điều kiện thí nghiệm, theo dõi trong thời gian 28 ngày về diễn biến sức khoẻ, tình hình bệnh và các triệu chứng lâm sàng.
3.3.1.3. Chỉ tiêu hiệu lực
* Thí nghiệm 1: Để kiểm nghiệm vaccine cúm gia cầm của Trung Quốc về chỉ tiêu hiệu lực, chúng tôi dùng 25 gà 4 tuần tuổi, giống ISA Brown. Gà thí nghiệm đ−ợc chia thành 2 lô:
+ Lô kiểm tra hiệu lực: 15 gà đ−ợc tiêm vaccine vào bắp ức, với liều 0,5 ml/gà.
+ Lô đối chứng: 10 gà không đ−ợc tiêm vaccine.
Lô kiểm tra hiệu lực và lô đối chứng đ−ợc nuôi tách biệt và đ−ợc sử dụng chung một qui trình nuôi d−ỡng. Gà thí nghiệm đ−ợc theo dõi trong 28 ngày về diễn biến sức khoẻ, tình hình bệnh và các triệu chứng lâm sàng.
Sau 3 tuần (21 ngày) theo dõi, gà thí nghiệm đ−ợc lấy máu, chắt huyết thanh và kiểm tra hàm l−ợng kháng thể kháng kháng nguyên cúm H5 bằng phản ứng HI.
* Thí nghiệm 2: Để kiểm nghiệm vaccine cúm gia cầm Hà Lan về chỉ tiêu hiệu lực, chúng tôi dùng 25 gà 4 tuần tuổi, giống ISA Brown. Gà thí nghiệm đ−ợc chia thành 2 lô:
+ Lô kiểm tra hiệu lực: 15 gà đ−ợc tiêm vaccine vào d−ới da cổ, với liều 0,5ml/con.
+ Lô đối chứng: 10 gà không đ−ợc tiêm vaccine.
Hai lô này đ−ợc nuôi riêng biệt nh−ng đ−ợc dùng chung một qui trình nuôi d−ỡng. Gà thí nghiệm đ−ợc theo dõi trong 28 ngày về diễn biến sức khoẻ, tình hình bệnh và các triệu chứng lâm sàng.
Sau 3 tuần (21 ngày) theo dõi, gà thí nghiệm đ−ợc lấy máu, chắt huyết thanh. Mẫu huyết thanh đ−ợc xét nghiệm kiểm tra kháng thể kháng kháng nguyên H5 bằng phản ứng HI.
3.3.2. Thử nghiệm vaccine
Dựa trên h−ớng dẫn của qui chế thử nghiệm, khảo nghiệm văc xin thú y, chúng tôi tiến hành khảo sát việc tiêm phòng vaccine cúm gia cầm ngoại nhập trên đàn gà ngoài thực địa [6].
Các vaccine cúm gia cầm của Hà Lan và cúm gia cầm của Trung Quốc đ−ợc thử nghiệm tại hai trại gà hậu bị h−ớng trứng giống ISA Brown, lứa tuổi 107 ngày, tại xã Lam Điền, huyện Ch−ơng Mỹ, tỉnh Hà tây.
* Trại 1 : Gà dùng trong thử nghiệm là 2900 gà hậu bị h−ớng trứng giống ISA Brown, 107 ngày tuổi, đ−ợc chia làm 2 nhóm.
+ Nhóm gà thí nghiệm: 2850 gà 107 ngày tuổi h−ớng trứng đ−ợc tiêm vaccine Hà Lan chủng H5N2.
- Tiêm vaccine lần 1: Liều tiêm 0,5 ml/con, đ−ờng tiêm d−ới da cổ. - Tiêm vaccine lần 2: sau khi tiêm lần thứ nhất 4 tuần. Liều tiêm 0,5 ml/con, đ−ờng tiêm d−ới da cổ.
+ Nhóm gà chỉ báo vaccine Hà Lan: 50 gà 107 ngày tuổi h−ớng trứng không đ−ợc tiêm vaccine , đ−ợc nuôi cùng với gà đ−ợc tiêm vaccine.
* Trại 2: Gà dùng trong thử nghiệm là 2900 gà hậu bị h−ớng trứng giống ISA Brown, 107 ngày tuổi, đ−ợc chia làm 2 nhóm.
+ Nhóm gà thí nghiệm: 2850 gà 107 ngày tuổi h−ớng trứng đ−ợc tiêm vaccine Trung Quốc chủng H5N2.
- Tiêm vaccine lần 1: Liều tiêm 0,5ml/con, đ−ờng tiêm bắp ức.
- Tiêm vaccine lần 2: sau khi tiêm lần thứ nhất 4 tuần. Liều tiêm 0,5ml/con, đ−ờng bắp ức.
+ Nhóm gà chỉ báo vaccine Trung Quốc: 50 gà 107 ngày tuổi h−ớng trứng không đ−ợc tiêm vaccine , đ−ợc nuôi cùng với gà đ−ợc tiêm vaccine. Gà đ−ợc nuôi tập trung tại các trại riêng biệt với các qui trình chăm sóc nuôi d−ỡng bình th−ờng, các qui trình phòng bệnh bình th−ờng và các qui trình vệ sinh phòng bệnh nh− đã đ−ợc khuyến cáo.
* Lịch tiêm vaccine và lấy mẫu trong thí nghiệm
Thời gian sau tiêm văc xin
(tuần) Cân gà Lấy mẫu (ổ nhớp, huyết thanh) Theo dõi, quan sát Ghi chú 0 + + Tiêm vaccine lần 1 3 + + 4 + + Tiêm vaccine lần 2, chuyển chuồng. 6 + + 8 + + + 10 + + + 12 + + 14 + + 15 + + 16 + + 17 + + 18 + + +
3.3.2.1. ảnh h−ởng của vaccine đến một số chỉ tiêu của gà
Trong quá trình thử nghiệm, theo dõi hàng ngày đàn gà khảo nghiệm vaccine về tình hình sức khoẻ, cụ thể nh−: tăng trọng, tỷ lệ chết, tỷ lệ đẻ và tình hình bệnh của đàn gà nhằm đánh giá các tác dụng phụ của vaccine.
3.3.2.2. Giám sát virus Cúm gà
Giám sát sự cảm nhiễm và sự l−u hành của virus đ−ợc tiến hành theo lịch 2 tuần/lần. Tại các thời điểm 0, 3, 4, 6, 8, 14, 16 tuần sau khi tiêm vaccine lần thứ nhất cho gà, chúng tôi lấy mẫu dịch ổ nhớp. Mẫu đ−ợc xét nghiệm bằng ph−ơng pháp tiêm truyền trên phôi gà và RT-PCR tại Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung −ơng
3.3.2.3. Đánh giá hiệu lực vaccine
Tr−ớc và sau tiêm vaccine, chúng tôi định kỳ lấy mẫu huyết thanh trong mỗi nhóm gà thí nghiệm đ−ợc tiêm vaccine và gà chỉ báo ở các thời điểm 0, 3, 4, 6, 8, 14, 16 tuần sau khi tiêm vaccine cho gà. Các mẫu đã đánh số đ−ợc bảo quản lạnh và gửi về Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung −ơng xét nghiệm hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên H5 bằng phản ứng HI.
3.3.3. Phản ứng HI
3.3.3.1. Nguyên liệu
+ Kháng nguyên chuẩn: Inactivated antigen H5N1 (Veterinary Laboratories Agency).
Kháng nguyên là virus cúm subtype H5 đ−ợc tiêm truyền vào xoang niệu mô của trứng gà có phôi. N−ớc trứng thu hoạch đ−ợc vô hoạt bởi β
propiolacton. Pha kháng nguyên H5 cho phản ứng HI là 8 đơn vị HA/50àl.
+ Hồng cầu: Hỗn dịch hồng cầu 0,5% đ−ợc chuẩn bị từ hồng cầu gà trống tr−ởng thành.
kháng virus cúm và kháng virus newcastle, đ−ợc lấy máu ở tĩnh mạch cánh bằng seringer 5 ml có chứa 1 ml Natri citrat 5%.
Rửa hồng cầu: Cho PBS (pH 7,2) vào ống ly tâm chứa hồng cầu lắc nhẹ. Ly tâm 1000 - 1500 vòng/phút trong 10 phút. Đổ bỏ huyết t−ơng ở trên, rửa hồng cầu tiếp 2 -3 lần bằng PBS đến khi dung dịch ở phía trên trong là đ−ợc.
Pha hồng cầu 0,5%: Bỏ n−ớc trong ở trên, lấy 0,5 ml hồng cầu cho vào 99,5 ml PBS lắc đều. Bảo quản ở 40C, dùng đ−ợc trong 4 - 5 ngày.
+ Huyết thanh: Huyết thanh làm phản ứng đ−ợc chắt từ mẫu máu, bảo quản ở 4-80C.
3.3.3.2. Phản ứng ng−ng kết hồng cầu (HA)
Phản ứng HA dùng để chuẩn độ kháng nguyên chuẩn H5 và kháng nguyên (là virus) phân lập từ bệnh phẩm. Dùng đĩa làm phản ứng ng−ng kết đáy chữ V gồm 12 cột và 8 hàng.
Tiến hành phản ứng:
- Cho 50 àl PBS (pH 7,2) vào tất cả các giếng.
- Cho 100àl kháng nguyên chuẩn hoặc kháng nguyên phân lập vào các giếng từ A1 ặ H1.
- Pha loãng bậc 2 kháng nguyên kiểm tra. Chuyển 50 àl từ giếng 1 đến giếng 11 rồi bỏ đi 50 àl.
- Cột 12 dùng đối chứng chỉ chứa: 50àl PBS và 50 àl hồng cầu gà 0,5%. - Cho 50 àl hồng cầu gà 0,5% vào các giếng phản ứng.
- Lắc nhẹ bằng tay hoặc bằng máy. Để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Đọc kết quả.
Đọc kết quả:
- Phản ứng (-) : Hồng cầu lắng đều ở d−ới đáy
- Phản ứng (+): Xảy ra hiện t−ợng ng−ng kết: Hồng cầu ng−ng kết thành cụm lấm tấm xung quanh giếng.
- Đọc hiệu giá ng−ng kết: Hiệu giá ng−ng kết kháng nguyên đ−ợc đánh giá ở độ pha loãng cao nhất còn có phản ứng ng−ng kết xảy ra.
3.3.3.3. Phản ứng HI
Dùng đĩa ng−ng kết 96 giếng, đáy chữ V.
Tiến hành phản ứng:
- Ghi mẫu huyết thanh cần kiểm tra lên đĩa ng−ng kết. - Cho 25 àl PBS vào tất cả các giếng trên đĩa.
- Cho 50 àl huyết thanh kiểm tra vào các giếng từ A1 ặ H1 (cột 1) - Pha loãng huyết thanh: Lấy 25 ml huyết thanh từ cột 1 chuyển sang cột 2 trộn đều với PBS của giếng, sau đó lại chuyển 25 àl từ cột 2 sang cột 3 cứ nh− vậy huyết thanh đ−ợc pha loãng đến cột 11 thì hút bỏ đi 25 àl huyết thanh. Cột 12 dùng để đối chứng.
- Cho kháng nguyên 8 đơn vị HA đã pha loãng ở trên vào các giếng có mẫu kiểm tra với l−ợng 25 àl. Nh− vậy kháng nguyên đ−ợc đ−a vào phản ứng HI là 4 đơn vị HA (8 đơn vị HA/50 àl, khi đ−a vào phản ứng là 4 đơn vị HA/25 àl).
- Lắc đều ở nhiệt độ phòng 30 phút.
- Cho 50 àl hồng cầu gà 0,5% đã lắc đều vào các giếng phản ứng. Để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Đọc kết quả khi cột đối chứng hồng cầu lắng hoàn toàn.
Đọc kết quả: