II. CƠ SỞ VẬT CHẤT DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN [1]
5. Vận chuyển vă tâi tổ hợp thông tin di truyền [7]
5.1.3. Bản chất của nhđn tố chuyển nạp [5]
Bản chất của nhđn tố chuyển nạp được Avery, MacLeod vă McCaty lăm sâng tỏ năm 1941. Trong những công trình nghiín cứu những chất có khả năng ức chế hoạt động của nhđn tố chuyển nạp, họ đê chứng minh rằng nhđn tố chuyển nạp chính lă ADN.
Người ta dùng chất tinh chế từ ADN của vi khuẩn S cho tâc động đến những vi khuẩn R thấy: một số ít vi khuẩn R biến thănh vi khuẩn S nhưng nếu cho văo những tế băo rời ADN đê xử lý bằng deoxyribonucease, enzyme lăm tan rê ADN thì không thấy hiện tượng chuyển nạp.
Đđy lă một sự thay đổi đặc hiệu, nghĩa lă một sự tổn thương của genotyp của những tế băo đê để thđm nhập những phđn tử ADN của những tế băo thuộc một genotyp khâc. Những thănh phần phđn tử lớn khâc của vi khuẩn như protein, không có hoạt tính chuyển nạp. Như vậy ADN có một hoạt động di truyền đặc hiệu, nó lă vật chất di truyền. Chỉ cần những nồng độ cực kỳ nhỏ (văi g/ml của ADN tinh khiết để tiến hănh sự chuyển nạp. Người ta chứng minh rằng, số lượng vi khuẩn được chuyển nạp, tỷ lệ thuận với nồng độ của ADN cho đến khi có một nồng độ bảo hòa.
Như thế ADN có đặc tính di truyền đó lă nguyín liệu vectơ của những tính trạng di truyền. Cấu trúc thứ cấp của ADN cho thấy rõ tính đặc hiệu của di truyền năy ở trình tự câc bazơ bố trí theo chiều dăi của mạch ADN
5.1.4. Điều kiện để có chuyển nạp
-Vi khuẩn cần chuyển nạp, nó phải ở trong một tình trạng sinh lý đặc biệt, trạng thâi
tiếp thu (khoảng 10-15% tế băo của quần thể, thông thường ở giai đoạn sinh trưởng giảm). Đó lă trạng thâi sinh lý giao thời cần thiết cho sự kết hợp ADN để sau năy xđm nhập văo hệ gen. Đó không phải lă tính trạng di truyền, nó chỉ xuất hiện trong điều kiện nuôi cấy nhất định, thay đổi tùy theo loăi vi khuẩn (pH, nhiệt độ, thăng bằng ion, khuấy lắc,...). Sự thay đổi của thănh tế băo lă điều kiện cần thiết cho sự xđm nhập của ADN.
-Kích thước vă số lượng của ADN: hiện tượng chuyển nạp chỉ xẩy ra với câc đoạn ADN có trọng lượng phđn tử vừa phải, từ 105-107. Câc đoạn nhỏ hơn 105 hoặc lớn hơn 107 đều không có khả năng chuyển nạp. Mỗi đoạn ADN chuyển nạp tương đương với một đoạn 1/200-1/500 hệ gen của tế băo cho. Có nghĩa lă phải chia nhỏ chuỗi ADN của tế băo cho ra 200-500, đoạn nhỏ câc đoạn năy mới có khả năng chuyển nạp.
-Sự phđn tích về hiện tượng chuyển nạp cho thấy độ 50 mảnh ADN được vi khuẩn kết hợp để biến nạp cho một tính trạng. Số lượng năy tương đương với số lượng của những mảnh ADN có phđn tử lượng 1x107 do nhđn giải phóng khi vi khuẩn dung giải.
-Nghiín cứu về khả năng chuyển nạp của Haemophilus vi khuẩn năy có khả năng tiếp nhận chừng 10 đoạn ADN chuyển nạp. Vă như thế, người ta nghĩ rằng trín bề mặt của tế băo nhận có câc thụ thể (receptor) tiếp nhđn một câch chọn lọc. -Số lượng tính trạng truyền đi tùy thuộc văo sự bố trí của gen tương ứng trín nhiễm sắc thể. Mỗi mảnh ADN có phđn tử lượng 1x107 chứa văi chục gen khâc nhau vă vi khuẩn chứa văi nghìn gen.
-Thănh phần môi trường cũng ảnh hưởng đến tần số chuyển nạp. Ví dụ có albumin vă phosphat trong môi trường lăm tăng tần số chuyển nạp, trâi lại cazein lăm giảm tần số chuyển nạp.
5.1..5. Câc giai đoạn của quâ trình chuyển nạp
Sự xđm nhập của câc ADN ngoại lai văo những tế băo có thẩm quyền chuyển nạp, xẩy ra văi phút sau khi tiếp xúc. Sự xđm nhập năy được xâc định bằng hiện tượng ADN trở nín không cảm ứng với deoxiribonucleasa cho thím văo môi trường.
Nghiín cứu trực tiếp với ADN được đânh dấu bằng P32 cho thấy, chỉ một phần ADN được kết hợp, lúc đầu xẩy ra một câch thuận nghịch sau đó theo một chiều. Ngay sau khi xđm nhập văo nhđn tế băo, ADN ngoại lai trở thănh một mạch duy nhất có tính chất trùng hợp cao, mạch kia bị tan rê ra thănh một thănh phần hòa tan trong acid. Sự tâch riíng hai mạch năy rất quan trọng, chỉ một mạch thôi được thu hút văo trong vi khuẩn, do đầu mút của nó gặp một phđn tử deoxiribonucleasa, sự kết đôi đặc hiệu của khúc ngắn ADN đê xđm nhập với một vùng đồng đẳng của hệ gen của vi khuẩn tiếp nhận, tiến hănh trín một đoạn kĩp của nhiễm sắc thể, chứ không phải trín một đoạn bổ sung.
Sự xđm nhập của mạch ADN ngoại lai văo hệ gen của vi khuẩn tiến hănh ngay trong văi phút (2-5 phút). Sự tâi tổ hợp cũng diễn ra rất nhanh. Một phđn tử chuyển nạp của ADN chỉ hoạt động một lần thôi. Nó không tan rê thănh từng khúc trong quâ trình tâi tổ hợp. Sự tâi tổ hợp tiến hănh sau khi hệ gen của vi khuẩn bị đứt, hai ADN kết hợp lại với sự tham gia của một enzyme thủy phđn những mạch nối photphodieste trín hai mạch.
ADN sau khi lọt văo tế băo vi khuẩn có thể có ba khả năng xẩy ra: ADN ngoại lai sẽ bị câc enzyme của tế băo phđn giải; tâi tổ hợp với plasmid; tâi tổ hợp văo nhiễm sắc thể của vi khuẩn. có hai cơ chế tâi tổ hợp, tâi tổ hợp tương đồng vă tâi tổ hợp đặc hiệu vị trí hay đặc hiệu thứ tư.
Tâi tổ hợp tương đồng lă quâ trình tâi tổ hợp trong đó ADN lạ lọt văo tế băo được liín kết với ADN của tế băo chủ qua việc ghĩp đôi đoạn tương đồng, bẻ vỡ vă trao đổi chĩo hai đoạn ADN có trình tự base giống nhau nhờ câc enzyme.
Tâi tổ hợp đặc hiệu vị trí hay đặc hiệu thứ tự, trâi lại chỉ cần một đoạn ADN tương đồng rất nhỏ dùng để nhận biết.
Sự phđn tâch câc phần tử nhđn chuyển nạp, tiến hănh qua câc thế hệ liín tục.
Sự hình thănh phenotyp của tính trạng chuyển nạp đòi hỏi sự tổng hợp những enzyme đặc hiệu dưới sự kiểm soât của ADN mới xđm nhập văo.
Streptococcus pneumoniae hấp thu vă chế biến ADN bất kỳ nguồn năo chẳng hạn, ADN từ tinh trùng câ hồi hay từ một Streptococcus pneumoniae khâc đều được hấp thu như nhau. Tuy nhiín, chỉ những ADN tương đồng với hệ gen của vi khuẩn thì nó mới được hợp nhất văo vă lăm thay đổi tính di truyền của loăi năy.
Chuyển nạp ở Haemophilus có những điểm khâc với vi khuẩn Gram dương nói trín ở một số điểm cơ bản, chỉ những ADN tương đồng (từ cùng một loăi hay những loăi thđn thuộc) mới được hấp thụ vă xđm nhập văo tế băo, ADN năy ở dạng sợi kĩp cho tới khi hợp nhất văo hệ gen của vi khuẩn nhận.
Ơ vi khuẩn tính trạng chuyển nạp tự nhiín thường xẩy ra lă tính khâng độc tố vă tính nguyín dưỡng đối với acid amine. Sự chuyển nạp phụ thuộc văo điều kiện sinh lý tế băo vă pha sinh trưởng. Tế băo chuyển nạp có bề mặt thay đổi, thănh tế băo xốp vă chúng có hoạt tính cao của câc enzyme ngoại băo, đồng thời tạo thănh câc yếu tố cần thiết cho biến nạp văo môi trường.
Ơ câc vi khuẩn, bình thường không xẩy ra chuyển nạp nhưng khi được cảm ứng trong phòng thí nghiệm nhờ xử lý tế băo bằng một trong câc phương phâp thì sẽ xẩy ra chuyển nạp. Chẳng hạn vi khuẩn E. coli khi xử lý bằng dung dịch CaCl2 vă bảo quản lạnh thì xẩy ra chuyển nạp.
5.1.6. Ứng dụng chuyển nạp trong nghiín cứu di truyền học
Hiện tượng chuyển nạp lă một phương tiện phđn tích di truyền. Nó cho phĩp định vị trín bản đồ di truyền của một nòi vi khuẩn, trín những vùng rất nhỏ hoặc của một gen quyết định một tính trạng. Người ta có thể lăm vô hoạt bằng câch gđy đột biến nhiều enzyme của vi khuẩn vă tâi tổ hợp bằng câch chuyển nạp. Chuyển nạp nó có thể cho phĩp nghiín cứu những đặc tính chức năng của vi khuẩn mă không thể nghiín cứu bằng tiếp hợp được, hiện tượng chuyển nạp đê phât hiện vă kiểm soât những gen hình thănh giâp mô, sự đề khâng với khâng sinh, nghiín cứu quâ trình hình thănh nha băo, đặc tính cố định nitơ phđn tử trong vi khuẩn
Rhizobium,...
Hiện tượng chuyển nạp có tầm quan trọng to lớn trong sinh học vì nó cho phĩp xâc định rằng sự tổng hợp protein được đặt dưới sự kiểm soât của ADN. Nó mở đường cho di truyền hóa học. Cho thấy rằng khi đột biến thì có một biến đổi ADN.
Nhờ hiện tượng chuyển nạp mă người ta nghiín cứu trong cấu trúc gen vă chúng ta biết rằng: gen chưa phải lă đơn vị nhỏ nhất của vật chất di truyền. Trong gen còn có câc locus khâc, những loại locus năy đều xâc định dấu hiệu mă gen xâc định, tuy nó ở vị trí khâc nhau của gen, từng locus có thể tâi tổ hợp trong quâ trình chuyển nạp.
Với câc vi khuẩn Gram dương thuộc chi Bacillus vă Streptomyces việc sử dụng câc thể nguyín sinh chất để chuyển nạp có ý nghĩa thực tế rõ rệt. Ơ câc vi khuẩn năy sự hấp thụ ADN plasmid cảm ứng với polyetilenglicol được thực hiện qua câc thể nguyín sinh chất thiếu vâch, hay trong trường hợp chuyền ADN nhiễm sắc thể qua sự dung hợp trực tiếp của câc thể nguyín sinh chất. Câc thể nguyín sinh chất đê dung hợp kết hợp gen của hai tế băo bố mẹ, có thể tâi sản thănh câc tế băo nguyín vẹn dưới câc điều kiện thực nghiệm xâc định. Câc thể tâi tổ hợp xuất hiện từ sự dung hợp như trín mang tính trạng cả hai bố mẹ nhờ quâ trình tâi tổ hợp tương đồng.
Gần đđy, phương phâp xung điện có hiệu quả cao đê được đưa văo sử dụng. Phương phâp năy tạp cho câc măng sinh học dễ thấm vă dễ dung hợp nhờ sự kích thích của một điện trường, đê được ứng dụng đầu tiín cho câc tế băo nhđn thật như lai câc tế băo thực vật. Tuy nhiín nhiều ADN plasmid của câc vi khuẩn Gram dương cũng như gram đm cũng có thể được chuyển nạp nhờ xung điện.
Ngăy nay hiện tượng chuyển nạp được ứng dụng nhiều trong sinh học phđn tử, đặc biệt trong quâ trình đưa vectơ tâi tổ hợp văo tế băo vi khuẩn E. coli hiện tượng chuyển nạp giúp gắn kết một đoạn gen văo tế băo vi khuẩn để từ đó có thể phât hiện câc tính chất của đoạn gen năy.
Nhờ hiện tượng chuyển nạp nín đê phât hiện được bản chất của hiện tượng khâng khâng sinh trong vi khuẩn.
Tải nạp lă sự truyền đi một mảnh nhỏ nguyín liệu di truyền, từ một vi khuẩn cho đến một vi khuẩn nhận qua một văi trung gian lă một phage vi khuẩn (thực khuẩn thể: Bacteriophage) gọi lă phage vectơ hoặc phage tải nạp. Muốn hiểu hiện tượng năy cần phải biết bản chất vă chu kỳ nhđn lín của phage vi khuẩn vă quâ trình sinh tan, hoăn toăn khâc quâ trình tải nạp nhưng có khi kết hợp với nhau.