Virus không có hệ thống enzyme cho nín chúng chỉ có thể được nuôi cấy trín môi trường tổ chức sống. Virus không thể phât triển trong câc môi trường nhđn tạo được. Tùy từng loại virus mă người ta có thể lựa chọn phương phâp nuôi cấy thích hợp.
5.1.1. Nuôi cấy trín động vật thí nghiệm
Đđy lă phương phâp cổ điển, đê được sử dụng từ lđu (Pasteur đê tiím virus dại văo nêo thỏ) vă ngăy nay còn được ứng dụng để phđn lập virus, để nghiín cứu bệnh lý, tâc dụng gđy bệnh trín cơ thể vă câc tổ chức riíng biệt, những đặc tính sinh học của virus. Tuy nhiín phương phâp năy còn tương đối cồng kềnh, mất nhiều thời gian, không kinh tế vă đặc biệt lă dễ gđy ô nhiễm vă lđy lan mầm bệnh.
Phương phâp năy, dùng huyễn dịch bệnh phẩm nghi có virus tiím cho động vật cảm thụ, sau một thời gian động vật cảm thụ sẽ có câc biểu hiện lđm săng. Căn cứ văo biểu hiện lđm săng vă bệnh tích đặc trưng khi mổ khâm, có thể kết luận sự có mặt của virus. Nếu biểu hiện lđm săng không lộ rõ ra, người ta cũng có thể xâc định hiệu giâ khâng thể trong mâu con vật, qua đó chứng minh sự có mặt của virus.
Nếu sau khi tiím, động vật không bị ốm, người ta cũng giết động vật sau 5-10 ngăy, dùng phủ tạng nghiền nât thănh huyễn dịch để tiím cho động vật mới ''tiím truyền mù''. Bằng câch năy sau 2-3 lần tiím có thể gđy được bệnh cảnh lđm săng hoặc ít ra cũng gđy được những biến đổi trong phủ tạng của con vật mă qua đó phân đoân sự tồn tại của virus.
Tùy từng loại virus mă có thể lựa chọn động vật cảm thụ. Ví dụ: virus Neucastle chọn gă giò, virus gđy viím nêo dùng chuột trắng, virus dịch tả lợn dùng lợn choai, virus cúm dùng sóc.
Tùy theo tính chất gđy bệnh của virus, vă tùy theo mục đích công việc nghiín cứu mă lựa chọn đường tiím thích hợp nhất. Ví dụ: virus đường hô hấp (cúm), thì giỏ văo mũi hoặc tiím văo khí quản; virus hướng thần kinh thì tiím văo nêo (dại, viím nêo); virus hướng thượng bì (virus đậu) thì xât lín da hoặc câc lỗ chđn lông, virus hướng phủ tạng thì tiím văo xoang bụng, dưới da hoặc bắp thịt.
Phương phâp tiím truyền virus qua động vật còn dùng để chế tạo câc loại vaccin hay câc khâng nguyín chẩn đoân.
Thuận lợi của phương phâp năy lă có thể nghiín cứu được bệnh lý trín con vật, tâc dụng gđy bệnh của virus trín toăn bộ cơ thể vă những tổ chức riíng biệt.
Nhược điểm: cồng kềnh, mất nhiều thời gian vă không kinh tế.
Đa số virus có thể phât triển trín môi trường phôi thai gă, do đó phương phâp năy được sử dụng rộng rêi để phđn lập, kiểm nghiệm, định loại virus, chế tạo khâng nguyín vă câc loại vaccin. Đđy lă phương phâp thuận lợi, tiết kiệm kinh phí vă cho kết quả nhanh chóng, có thể nuôi cấy hăng loạt phôi gă vă thu được một lượng virus lớn.
Lấy trứng gă đê thụ tinh cho ấp ở 380C ở độ ẩm 60% tùy thuộc văo loại virus, mă chọn tuổi phôi thích hợp thường 6-13 ngăy vă lựa chọn đường tiím văo câc tổ chức khâc nhau của phôi.
Sử dụng phương phâp năy cần chú ý
Với virus cảm nhiễm đường hô hấp thì tiím văo túi niệu hoặc túi ối, măng niệu đệm
hoặc nêo, với virus hướng da thì tiím văo măng niệu đệm, còn đối với virus hướng thần kinh thì tiím văo túi lòng đỏ, măng niệu đệm hoặc măng nêo.
Sau khi tiím dùng paraphin vô trùng gắn lín vị trí tiím, rồi tiếp tục ấp trong tủ ấm 370C trong 2-4 ngăy, sau đó mổ trứng vă lấy câc tổ chức chứa virus. Dựa văo biến đổi đại thể của câc tổ chức phôi mă đânh giâ sự phât triển của virus. Ví dụ: nuôi cấy virus đậu văo măng niệu đệm, măng niệu đệm sẽ dăy lín, hoặc khi tiím virus Neucastle văo túi niệu sau 24-48 giờ, có xuất huyết trín phôi, phôi có thể bị phù.
Trong trường hợp không gđy được bệnh tích biến đổi có thể nhìn thấy được, người ta có thể phât hiện sự nhđn lín của virus trong phôi bằng câch tiím dịch thể câc túi hoặc huyễn dịch câc tổ chức phôi nghiền nât văo động vật cảm thụ, sau đó xĩt nghiệm phản ứng huyết thanh.
Ngoăi phôi gă người ta có thể dùng phôi vịt để nuôi cấy virus. Ví dụ: virus dịch tả vịt. Ngoăi đường tiím thích hợp phải chọn liều tiím phù hợp, trong virus học có hai loại liều tiím:
+Liều tiím thực tế ml, thông thường 0,2ml/phôi.
+Liều tiím cần thiết: biểu thị bằng nồng độ pha loêng của virus theo chỉ số LD50 (Lethal dosis) tức liều tối thiểu gđy chết 50% hoặc theo chỉ số ID50 (Infection dosis) tức liều gđy nhiễm 50%.
5.1.3. Nuôi cấy virus trín tổ chức tế băo
Đđy lă phương phâp khoa học tiín tiến được sử dụng rộng rêi trong y học vă thú y học để nghiín cứu câc virus như nuôi cấy, phđn lập, giâm định, chuẩn độ virus, xâc định tính chất huyết thanh học, quan sât hình thâi siíu cấu trúc của virus vă đặc biệt dùng môi trường tế băo tổ chức, để chế tạo vaccin.
Nguyín tắc: nếu lấy một tổ chức tế băo cho văo môi trường dinh dưỡng thích hợp thì câc tế băo sống sẽ bắt đầu phđn chia. Nếu cứ sau một thời gian lại rửa vă cho thím dung dịch mới, thì tế băo sẽ phđn chia không ngừng. Dùng câc tế băo đó để cấy virus.
Để tạo ra câc tế băo tổ chức người ta lấy tế băo từ câc mô của người vă động vật như người ta dùng tế băo sơ phôi gă hay tế băo Hela (tế băo da lấy từ cô gâi có tín Hela), măng ối, thận, phôi, thận lợn, tinh hoăn động vật,...
Nuôi tế băo: sau khi lấy mô, người ta dùng men trypsin phâ hủy mô liín kết giữa câc tế băo để tâch chúng ra thănh câc tế băo riíng lẻ sau đó quay li tđm với dung dịch muối đệm để loại hết trypsin rồi thím văo đó môi trường dinh dưỡng để nuôi tế băo.
Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy tế băo được chia lăm hai loại: tự nhiín (có nguồn gốc từ câc chất có sẵn như huyết thanh động vật, nước ĩp nhau thai, chất đệm) vă tổng hợp (gồm nhiều chất khâc nha như câc acid amin, hydrat carbon, lipit, muối khoâng có thím huyết thanh để chúng phđn chia tăng số lượng tế băo.
Trộn môi trường dinh dưỡng trín với hỗn dịch tế băo rồi rót văo câc bình dẹt hoặc đĩa petri, đặt nằm ở 370C, sau 6-7 ngăy câc tế băo sẽ mọc dính chặt văo đây bình tạo thănh một lớp tế băo.
Dùng hỗn dịch virus pha loêng 10-2-10-1 trong dung dịch muối đệm Hank cấy văo trong bình đựng tế băo một lớp, sao cho vừa đủ ướt mặt lớp tế băo. Sau đó đổ dung dịch môi trường mới văo bình.
Khi nuôi cấy trín môi trường tế băo, song sng với sự nhđn lín về số lượng của virus lă sự thoả hóa của tế băo thể hiện ở sự biến đổi rất đặc trưng ở tế băo do virus gđy ra. Hiện tượng năy được gọi lă sự hủy hoại tế băo. CPE (Cyto pathogen effect). Căn cứ văo CPE khi quan sât trín kính hiển vi quang học, có thể đânh giâ được kết quả nuôi cấy virus, CPE có những bệnh tích đặc trưng sau:
-Tế băo co tròn, nguyín sinh chất bị mất, chỉ còn nhđn.
-Tạo nín sự dung băo, tế băo co tròn, nguyín sinh chất mất, nhđn vỡ tan,
-Tạo câc cầu nối giữa câc tế băo giữa tế băo lănh vă tế băo bị nhiễm có nhiều câc cầu nối, tạo thănh từng đâm tế băo.
-Tạo nín câc hợp băo: câc tế băo hợp lại chung một măng có rất nhiều nhđn. -Tạo nín câc tiểu thể bao hăm nằm trong nhđn, trong nguyín sinh chất.
Thời gian nhđn lín của câc virus có khâc nhau, nói chung từ 2-10 ngăy. Virus nhđn lín gđy hủy hoại tế băo, sự hủy hoại năy có thể phât hiện được dưới kính hiển vi quang học hoặc thím câc chất chỉ thị mău văo môi trường vă quan sât bằng mắt thường. Câc tế băo không bị virus hủy hoại vẫn phât triển bình thường vă sinh ra nhiều acid trong môi trường (lăm pH giảm xuống, lăm đỏ phenol trong dung dịch chuyển sang mău văng). Nếu môi trường không thay đổi chứng tỏ tế băo đê bị hủy hoại.
CPE (Cytopathic effect). Căn cứ văo CPE khi quan sât trín kính hiển vi quang học, có thể đânh giâ được kết quả nuôi cấy virus, CPE có những bệnh tích đặc trưng sau:
-Tế băo co tròn, nguyín sinh chất bị mất, chỉ còn nhđn.
-Tạo nín sự dung băo, tế băo co tròn, nguyín sinh chất mất, nhđn vỡ tan,
-Tạo câc cầu nối giữa câc tế băo giữa tế băo lănh vă tế băo bị nhiễm có nhiều câc cầu nối, tạo thănh từng đâm tế băo.
-Tạo nín câc hợp băo: câc tế băo hợp lại chung một măng có rất nhiều nhđn. -Tạo nín câc tiểu thể bao hăm nằm trong nhđn, trong nguyín sinh chất.
Để tạo nín câc tế băo nuôi, người ta thường dùng câc tế băo lấy từ câc mô của người vă động vật cho văo môi trường dinh dưỡng vă để ở nhiệt độ thích hợp thì câc tế băo năy sẽ sống vă bắt đầu phđn chia, cứ sau một thời gian lại rửa vă thím dung dịch dinh dưỡng mới thì câc tế băo sẽ phđn chia không ngừng, sử dụng câc tế băo đó để nuôi cấy virus.
5.1.4. Nuôi cấy virus trín môi trường biệt lập
Dùng mô, phôi, khí quản, gan, lâch, da ruột, thận, thymus của phôi bò 2-4 thâng tuổi, hoặc phôi lợn cừu 1,5 thâng tuổi.
Ưu điểm của phương phâp năy lă virus được tâi sản trong điều kiện giống tự nhiín hơn lă tâi sản trín lứa cấy tế băo riíng biệt, chúng phât triển, trao đổi chất vă cấu trúc hoăn toăn khâc mô phât triển trong cơ thể.
5.1.5. Nuôi cấy thực khuẩn thể
Dùng câc tế băo vi khuẩn cảm thụ phage được nghiín cứu. Ví dụ cấy phage T4 dùng lứa cấy E. coli. Khi nhiễm văo môi trường nuôi cấy vi khuẩn, phage sẽ chui văo tế băo vă tấn công tế băo. Môi trường đang đục trở nín trong suốt. Lại tiến hănh cấy truyền bằng câch lấy dịch trong có chứa phage để nhiễm văo lứa cấy vi khuẩn mới.
5.2. Nuôi cấy virus nhiễm bệnh thực vật
Dùng câc cđy cảm thụ, trồng riíng trong nhă kính. Thường nuôi cđy trín một năm, trồng theo nhiều đợt vă tiến hănh cấy truyền từ cđy năy sang cđy khâc non hơn đang ở thời kỳ phât triển mạnh.
- Lấy dịch lâ ĩp, lọc qua măng lọc vă tiím văo cđy. - Lấy nhựa tiím truyền thẳng.
- Đối với loại virus chỉ lan truyền trong thiín nhiín nhờ côn virus thì dùng côn virus lăm trung gian.