b. Gelatin
3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Nguyên liệu
- Xoài
- đường saccharose
- Nấm men Saccharomyces cerevisiae - Chitosan
- Gelatin (Pháp)
- Các chế phẩm enzyme thương mại (Termamyl 120L, AMG 300L của hãng Novo- đan Mạch)
3.1.2 Thiết bị và dụng cụ
- Máy xay nguyên liệu - Bếp ựiện
- Máy so màu UV - pH kế, Bx kế - Rượu kế thuỷ tinh - Cân ựiện tử
- Ống ựong, pipet, buret
3.1.3 Các hoá chất ựạt chuẩn phân tắch
- Methanol - Acid cromotropic - HClựự - H2SO4ựự - NaHSO3 - KI - Iod - Anilin - KMnO4
- Cồn tuyệt ựối 99,8% - Dung dịch Fehling (A+B) - Pb(CH3COO)2 30% - Na2SO4 bão hòa
3.2 Phương pháp thắ nghiệm
3.2.1 Thắ nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt ựộ, nồng ựộ và thời gian
thủy phân ựến hoạt tắnh xúc tác của enzyme glucoamylase trên dịch xoài
a. Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt ựộ ựến hoạt tắnh của enzyme glucoamylase
Ớ Mục ựắch: Tìm ra nhiệt ựộ và pH tối ưu của glucoamylase trong khoảng nhiệt ựộ, pH nghiên cứu
Ớ Bố trắ thắ nghiệm:
Thắ nghiệm ựược tiến hành với 2 nhân tố, 2 lần lặp lại Nhân tố A: pH Phân tắch hàm lượng ựường khử A1 A2 A3 A4 B3 B1 B2 B4 B1 B2 B3 B4 Dịch pure xoài Cân
Chỉnh pH, bổ sung enzyme glucoamylase
B3
B1 B2 B4
B3
B1 B2 B4
A1: 3,5 A3: 4,5 A2: 4,0 A4: 5,0 Nhân tố B: nhiệt ựộ B1: 500C B3: 600C B2: 550C B4: 650C Tổng số nghiệm thức: 4ừ4= 16. Tổng số thắ nghiệm : 4ừ4ừ2= 32 Ớ Tiến hành thắ nghiệm:
Xoài chắn xay nhuyễn sau ựó chần 950C trong 2 phút ựể vô hoạt enzyme phenolase, hạn chế sự hóa nâu của dịch xoài. Sau ựó cho vào túi PE và bảo quản lạnh.
Lấy xoài ra rã ựông dưới vòi nước lạnh. Mỗi mẫu lấy 40g pure xoài và 160g nước cất theo tỷ lệ 1: 4. Sau ựó chỉnh pH 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 rồi bổ sung 0,02% enzyme và theo dõi nhiệt ựộ như trên trong thời gian 30 phút, sau ựó vô hoạt enzyme ở 900C trong vòng 5 phút.
Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng ựường khử tạo thành
b. Khảo sát ảnh hưởng của nồng ựộ enzyme và thời gian thuỷ phân tinh bột trên nguyên liệu xoài
Ớ Mục ựắch: Tìm ra nồng ựộ và thời gian thủy phân tối ưu của enzyme glucoamylase trong ựiều kiện thắ nghiệm có sẵn
Ớ Bố trắ thắ nghiệm
Thắ nghiệm ựược tiến hành với 2 nhân tố, 2 lần lặp lại Nhân tố C: nồng ựộ enzyme glucoamylase
C1: 0,01% C3: 0,03% C2: 0,02% C4: 0,04% Nhân tố D: thời gian thuỷ phân
D1: 10 phút D3: 30 phút D2: 20 phút D4: 40 phút Tổng số nghiệm thức: 4 4= 16. Tổng số thắ nghiệm : 4 4 2= 32 D1 D2 D3 D4 C4 Dịch pure xoài D1 D2 D3 D4 C1 C2 C3 Cân
Chỉnh pH, nhiệt ựộ theo kết quả khảo sát trên
Bổ sung enzyme glucoamylase
D1 D2 D3 D4 D1 D2 D3 D4
Vô hoạt enzyme
Phân tắch hàm lượng ựường khử
Ớ Tiến hành thắ nghiệm:
Mỗi mẫu lấy 40g pure xoài và 160g nước cất theo tỷ lệ 1: 4. Sau ựó chỉnh pH và nhiệt ựộ (lấy kết quả thắ nghiệm trên). Bổ sung enzyme ở 4 mức nồng ựộ: 0,01; 0,02; 0,03; 0,04% và theo dõi ở 4 mức thời gian khác nhau: 10, 20, 30, 40 phút. Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng ựường khử.
3.2.2 Thắ nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt ựộ, nồng ựộ và thời gian
ựến hoạt tắnh xúc tác của enzyme α- amylase trên nguyên liệu xoài
a. Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt ựộ ựến hoạt tắnh của α- amylase
Ớ Mục ựắch: Tìm ra nhiệt ựộ và pH tối ưu của α-amylase trong khoảng nhiệt ựộ 80-950C và pH 5,5-7,0. F1 F2 F3 F4 E4 Dịch pure xoài F1 F2 F3 F4 E1 E2 E3 Cân Chỉnh pH
Bổ sung enzyme α- amylase
F1 F2 F3 F4 F1 F2 F3 F4
Vô hoạt enzyme α-amylase
Bổ sung enzyme glucoamylase (kết quả thắ nghiệm 1) Vô hoạt enzyme glucoamylase
Phân tắch hàm lượng ựường khử
Ớ Bố trắ thắ nghiệm
Thắ nghiệm ựược tiến hành với 2 nhân tố, 2 lần lặp lại Nhân tố E: pH E1: 5,5 E3: 6,5 E2: 6,0 E4: 7,0 Nhân tố F: nhiệt ựộ F1: 800C F3: 900C F2: 850C F4: 950C Tổng số nghiệm thức: 4ừ4= 16. Tổng số thắ nghiệm : 4ừ4ừ2= 32 Ớ Tiến hành thắ nghiệm
Lấy xoài ra rã ựông dưới vòi nước lạnh. Mỗi mẫu lấy 40g pure xoài và 160g nước cất theo tỷ lệ 1:4. Sau ựó chỉnh pH 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 và theo dõi ở 4 mức nhiệt ựộ như trên: 80, 85, 90, 950C trong thời gian 30 phút. Tiếp theo ta tiến hành bổ sung enzyme glucoamylase (pH, nhiệt ựộ, nồng ựộ, thời gian lấy từ kết quả thắ nghiệm 1). Sau ựó ta vô hoạt enzyme glucoamylase bằng cách gia nhiệt dịch thủy phân ựến 900C trong 5 phút và xác ựịnh hàm lượng ựường khử.
b. Khảo sát ảnh hưởng của nồng ựộ và thời gian thủy phân ựến hoạt tắnh của α- amylase.
G1 G2 G3 G4 H4 Dịch pure xoài G1 G2 G3 G4 H1 H2 H3 Cân
Chỉnh pH, nhiệt ựộ theo kết quả trên
Bổ sung enzyme α-amylase
G1 G2 G3 G4 G1 G2 G3 G4
Vô hoạt enzyme α-amylase
Bổ sung enzyme gluco-amylase (kết quả thắ nghiệm 1)
Vô hoạt enzyme gluco-amylase
Phân tắch hàm lượng ựường khử
Ớ Bố trắ thắ nghiệm
Thắ nghiệm ựược tiến hành với 2 nhân tố, 2 lần lặp lại. Mẫu ựối chứng (đC): không bổ sung enzyme.
Nhân tố G: nồng ựộ enzyme
G1: 0,01% G3: 0,03%
G2: 0,02% G4: 0,04% Nhân tố H: thời gian thuỷ phân
H1: 10 phút H3: 30 phút H2: 20 phút H4: 40 phút
Tổng số nghiệm thức: (4ừ4)+1= 17. Tổng số thắ nghiệm : 17ừ2 = 34
Ớ Tiến hành thắ nghiệm
Lấy xoài ra rã ựông dưới vòi nước lạnh. Mỗi mẫu lấy 40g pure xoài và 160g nước cất theo tỷ lệ 1: 4. Sau ựó chỉnh pH, nhiệt ựộ từ kết quả khảo sát trên rồi bổ sung enzyme α- amylase với các nồng ựộ 0,01; 0,02; 0,03; 0,04% và theo dõi ở 4 mức thời gian như trên: 10; 20; 30; 40 phút. Tiếp theo ta tiến hành bổ sung enzyme glucoamylase (pH, nhiệt ựộ, nồng ựộ, thời gian lấy từ kết quả thắ nghiệm 1). Sau ựó ta vô hoạt enzyme glucoamylase bằng cách gia nhiệt dịch thủy phân ựến 900C trong 5 phút và xác ựịnh hàm lượng ựường khử.
3.2.3 Thắ nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung chitosan và gelatin ựộ trong và lượng tạp chất của rượu thành phẩm ựộ trong và lượng tạp chất của rượu thành phẩm
Ớ Mục ựắch: khảo sát khả năng làm trong và lượng tạp chất của rượu thành phẩm khi bổ sung chitosan và gelatin.
Bố trắ thắ nghiệm
Thắ nghiệm ựược bố trắ với 1 nhân tố, 2 lần lặp lại
Mẫu ựối chứng (đC) thì không bổ sung chitosan và gelatin Nhân tố C*: nồng ựộ chitosan C*1: 0,2% C*3: 0,4% C*2: 0,3% C*4: 0,5% Nhân tố G: nồng ựộ gelatin Dịch pure xoài Lọc thô Lên men phụ Chiết dịch Thành phẩm Bổ sung chitosan C*1,C*2,C*3 ,C*4 Lên men chắnh Cân Phối chế pH 4,5, 220Bx
Bổ sung α- amylase, gluco-amylase
Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae (0,2%) Thanh trùng NaHSO3 122mg/lắt, 30 phút
Bổ sung gelatin G*1, G*2, G*3, G*4
G*1: 0,1% G*3: 0,3% G*2: 0,2% G*4: 0,4% Chỉ tiêu theo dõi:
- độ trong của rượu thành phẩm Tổng số thắ nghiệm : 9 ừ2 = 18 c. Tiến hành thắ nghiệm
Lấy pure xoài ra rã ựông dưới vòi nước lạnh. Mỗi mẫu thắ nghiệm gồm 1,2 kg pure xoài pha với 4,8 kg nước theo tỉ lệ 1:4, thắ nghiệm ựược tiến hành với 9 mẫu sau khi lên men dịch xoài. Ta tiến hành bổ sung α-amylase (pH, nhiệt ựộ, nồng ựộ, thời gian theo kết quả tối ưu ở thắ nghiệm 2) và glucoamylase (pH, nhiệt ựộ, nồng ựộ, thời gian theo kết quả tối ưu ở thắ nghiệm 1). Sau ựó chỉnh pH dịch lên men là 4,5 và 0Bx 22% rồi thanh trùng bằng NaHSO3 122mg/l trong vòng 30 phút. Chủng nấm men 0,2% vào dịch lên men cho quá trình lên men chắnh, theo dõi quá trình lên men chắnh dựa vào ựộ cồn sinh ra, hàm lượng ựường khử, 0Bx.
Sau quá trình lên men chắnh, dịch xoài ựược lọc thô ựể thu dịch lọc rồi bổ sung chitosan C*1, C*2, C*3, C*4, gelatin G*1, G*2, G*3, G*4 và một mẫu ựối chứng thì không bổ sung chitosan hoặc gelatin. để lắng tự nhiên dịch lọc trong 7 ngày lên men phụ rồi tiến hành chiết rượu ra ựể ựo ựộ trong của rượu thành phẩm bằng máy UV-Vis Spectrophotometer và kiểm tra tạp chất của rượu thành phẩm ựồng thời so sánh với tiêu chuẩn Việt Nam.
3.3 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu từ các thắ nghiệm trên ựược xử lý thống kê bằng phầm mềm Statgraphics 4.0
CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Ảnh hưởng của nhiệt ựộ, pH, nồng ựộ và thời gian thủy phân của enzyme glucoamylase ựến quá trình thủy phân tinh bột từ nguyên liệu xoài
Ớ Ảnh hưởng của nhiệt ựộ và pH lên hoạt tắnh của enzyme glucoamylase Hàm lượng ựường có sẵn trong xoài rất thấp không ựủ cho nấm men hoạt ựộng, do ựó ựể có hàm lượng ựường cao hơn thì cần có sự hoạt ựộng thủy phân của enzyme glucoamylase chuyển hóa glucid trong xoài thành ựường. Nhiệt ựộ và pH là hai yếu tố rất quan trọng ựối với hoạt ựộng của enzyme glucoamylase. Vì vậy, thắ nghiệm khảo sát nhiệt ựộ, pH của enzyme glucoamylase ựược tiến hành với các khoảng nhiệt ựộ 50, 55, 60, 650C và ở các pH: 3,5; 4,0; 4,5; 5,0.
Bảng 3. Hàm lượng ựường khử trung bình theo pH
pH Hàm lượng ựường khử trung bình (%) 3,5 1,423a 4,0 1,448a 4,5 1,409a 5,0 1,420a
Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột (hoặc hàng) sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) theo phép thử LSD
Bảng 3 cho thấy pH 4,0 hàm lượng ựường khử thu ựược cao nhất. Tuy nhiên kết quả thống kê lại cho thấy không có sự khác biệt ý nghĩa ở các khoảng pH khảo sát. Từ ựó có thể kết luận rằng khoảng pH từ 3,5 ựến 5,0 ựều thắch hợp cho glucoamylase hoạt ựộng.
Bảng 4. Hàm lượng ựường khử trung bình theo nhiệt ựộ
Nhiệt ựộ (0C) Hàm lượng ựường khử
trung bình (%)
50 1,386b
55 1,416ab
60 1,446a
65 1,452a
Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột (hoặc hàng) sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) theo phép thử LSD
Nhiệt ựộ 650C hoạt ựộng thủy phân của glucoamylase cho hàm lượng ựường khử cao nhất. Tuy nhiên hàm lượng ựường khử tạo ra không có sự khác biệt ý nghĩa giữa ba nhiệt ựộ 55, 60, 650C. Do ựó ta có thể chọn nhiệt ựộ 550C cho hoạt ựộng của glucoamylase vì lợi ắch kinh tế.
Bảng 5. Hàm lượng ựường khử thu ựược sau quá trình thủy phân dịch xoài bằng enzyme glucoamylase ứng với các nhiệt ựộ và pH khác nhau (%)
500C 550C 600C 650C
3,5 1,394cd 1,452bc 1,394cd 1,452bc
4,0 1,341d 1,423bcd 1,545a 1,481ab
4,5 1,341d 1,394cd 1,452bc 1,452bc
5,0 1,469abc 1,394cd 1,394cd 1,422bcd
Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột (hoặc hàng) sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) theo phép thử LSD
Các giá trị ghi trong bảng là kết quả trung bình của 2 lần lặp lại.
pH
1.20 1.25 1.30 1.35 1.40 1.45 1.50 1.55 1.60 3.5 4 4.5 5 pH H àm l ư ợ n g ự ư ờ n g k h ử ( % ) 50 55 60 65
Hình 11. Ảnh hưởng của pH và nhiệt ựộ ựến hàm lượng ựường khử sinh ra khi thủy phân tinh bột trong pure xoài bằng enzyme glucoamylase
Bảng 5 và ựồ thị hình 11 cho thấy pH 4, nhiệt ựộ 600C hàm lượng ựường khử thu ựược là cao nhất nghĩa là hoạt ựộng của glucoamylase là mạnh nhất.
Kết quả thống kê cho thấy hàm lượng ựường khử tạo ra không có sự khác biệt ý nghĩa giữa các pH 4, nhiệt ựộ 600C; pH 4, nhiệt ựộ 650C; pH 5, nhiệt ựộ 500C. Do ựó ta có thể chọn pH 5, nhiệt ựộ 500C cho hoạt ựộng thủy phân của glucoamylase nhằm tiết kiệm năng lượng.
Ớ Ảnh hưởng của nồng ựộ và thời gian thủy phân ựến quá trình thủy phân tinh bột từ nguyên liệu xoài.
Nhân tố thời gian và nồng ựộ cũng tác ựộng rất lớn ựến hoạt ựộng thủy phân của enzyme glucoamylase. Thắ nghiệm tiến hành với các nồng ựộ enzyme glucoamylase: 0,01; 0,02; 0,03; 0,04% và các mức thời gian 10, 20, 30, 40 phút. Thắ nghiệm tiến hành ở nhiệt ựộ 500C, pH 5,0.
Bảng 6. Hàm lượng ựường khử trung bình theo nồng ựộ enzyme Nồng ựộ enzyme (%) Hàm lượng ựường khử trung bình (%) 0,01 1,430b 0,02 1,461ab 0,03 1,484a 0,04 1,491a
Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột (hoặc hàng) sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) theo phép thử LSD
Bảng 6 cho thấy hàm lượng ựường khử tăng cùng với nồng ựộ enzyme bổ sung vào và ựạt cao nhất ở nồng ựộ 0,04%. Tuy nhiên kết quả thống kê cho thấy hàm lượng ựường khử tạo ra không có sự khác biệt ý nghĩa ở các nồng ựộ enzyme bổ sung
0,02; 0,03; 0,04%. Do ựó có thể chọn nồng ựộ enzyme glucoamylase 0,02% bổ sung vào dịch xoài vì mục tiêu kinh tế.
Bảng 7. Hàm lượng ựường khử trung bình theo thời gian thủy phân Thời gian thủy
phân (phút) Hàm lượng ựường khử trung bình (%) 10 1,387c 20 1,452b 30 1,514a 40 1,514a
Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột (hoặc hàng) sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) theo phép thử LSD
Thời gian thủy phân 30, 40 phút hoạt ựộng thủy phân của glucoamylase cho hàm lượng ựường khử cao nhất và không khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê. Do ựó có thể chọn thời gian thủy phân là 30 phút cho hoạt ựộng thủy phân của glucoamylase. Bảng 8. Hàm lượng ựường khử thu ựược sau quá trình thủy phân dịch xoài bằng enzyme glucoamylase ứng với các nồng ựộ và thời gian khác nhau (%)
10 phút 20 phút 30 phút 40 phút 0,01% 1,394de 1,422cde 1,452bcd 1,452bcd 0,02% 1,365e 1,452bcd 1,513ab 1,513ab 0,03% 1,394de 1,452bcd 1,545a 1,545a 0,04% 1,394cd 1,481abc 1,545a 1,545a
Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột (hoặc hàng) sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) theo phép thử LSD
Các giá trị ghi trong bảng là kết quả trung bình của 2 lần lặp lại.
Nồng ựộ
1.25 1.30 1.35 1.40 1.45 1.50 1.55 1.60 0.01% 0.02% 0.03% 0.04% Nồng ựộ enzyme (%) H àm l ư ợ n g ự ư ờ n g k h ử ( % ) 10 phút 20 phút 30 phút 40 phút
Hình 12. Ảnh hưởng của nồng ựộ enzyme ựến hàm lượng ựường khử sinh ra ở các khoảng thời gian thủy phân khác nhau
Bảng 8 và ựồ thị hình 12 cho thấy hàm lượng ựường khử tạo ra và ựạt cao nhất ở nồng ựộ enzyme glucoamylase là 0,03%, thời gian thủy phân là 30, 40 phút; 0,04% và thời gian thủy phân là 30, 40 phút. Kết quả thống kê cho thấy hàm lượng ựường khử tạo ra không có sự khác biệt ý nghĩa giữa các mẫu bổ sung enzyme glucoamylase với các nồng ựộ 0,02%, thời gian thủy phân là 30, 40 phút; 0,03%, thời gian thủy phân là 30, 40 phút; 0,04%, thời gian thủy phân là 30, 40 phút; 0,04%, thời gian thủy phân 20 phút. Do ựó, xét về lợi ắch kinh tế có thể chọn nồng ựộ enzyme glucoamylase là 0,02% và thời gian thủy phân 30 phút.
Do ựó, ta chọn pH 5,0, nhiệt ựộ 500C, nồng ựộ 0,02% và thời gian là 30 phút cho hoạt ựộng thủy phân của glucoamylase cho thắ nghiệm tiếp theo.
4.2 Ảnh hưởng của nhiệt ựộ, pH, nồng ựộ và thời gian thủy phân của enzyme α- amylase, glucoamylase ựến quá trình thủy phân tinh bột từ nguyên liệu xoài. α- amylase, glucoamylase ựến quá trình thủy phân tinh bột từ nguyên liệu xoài.
a. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ và pH lên hoạt tắnh xúc tác của enzyme α-amylase,
glucoamylase
Thắ nghiệm ựược tiến hành với các nhiệt ựộ của enzyme α-amylase: 80, 85, 90, 950C và ở các pH: 5,5; 6,0; 6,5; 7,0. Cố ựịnh nhiệt ựộ, pH, nồng ựộ, thời gian của glucoamylase lấy từ kết quả thắ nghiệm 1.
Bảng 9. Hàm lượng ựường khử trung bình theo pH pH Hàm lượng ựường khử trung bình (%) 5,5 1,513b 6,0 1,548a 6,5 1,513b 7,0 1,481b
Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột (hoặc hàng) sai khác có ý nghĩa thống kê