4.4.1 Lấy mẫu
Đặc tính sinh lý sinh sản của chó rất khác với những loài khác. Do đó, tỷ lệ trứng chín trong IVM và hình thành phôi trong IVF rất thấp. Mặt khác, theo khảo sát của Lâm Thị Ngọc Thanh (2006), tỷ lệ trứng thu đƣợc và tỷ lệ trứng chín cao nhất ở giai đoạn xoang nang, do đó nên chọn những chó trong giai đoạn động dục hoặc trƣớc động dục.
Chó đực phải có tinh hoàn lớn nhằm đảm bảo nồng độ và hoạt lực tinh trùng cho thụ tinh.
Dung dịch trữ mẫu phải đƣợc bổ sung kháng sinh vào mỗi ngày lấy mẫu để hạn chế sự nhiễm khuẩn.
Mẫu sau khi lấy phải đƣợc vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt.
Buồng trứng nên đƣợc trữ ở 37oC trong quá trình bảo quản.
Chú ý khâu sát trùng mẫu và dụng cụ vì đây là nguồn mẫu lấy từ ngoài nên khả năng nhiễm là rất cao.
4.4.2 Thao tác trong phòng thí nghiệm
Tinh hoàn nếu nhƣ chƣa đƣa vào tủ cấy làm liền thì phải đƣợc trữ trong tủ lạnh, nhằm hạn chế sự hoạt động của tinh trùng do đó kéo dài thời gian sống của tinh trùng.
Tinh hoàn và buồng trứng sau khi mang về phòng thí nghiệm phải đƣợc sát trùng cẩn thận, tiến hành cắt bỏ màng bao ngoài, cho vào đĩa petri và đƣợc dán chặt bằng keo parafilm để hạn chế nhiễm khuẩn.
Tủ cấy và dụng cụ thao tác phải đƣợc chiếu tia UV trƣớc mỗi lần làm, tất cả dụng cụ phải đƣợc sát trùng cẩn thận trƣớc khi mang vào phòng cấy và tủ cấy vô trùng.
Tinh trùng từ phần đuôi phó tinh hoàn đƣợc lấy trực tiếp từ lò mổ, do đó hoạt lực và nồng độ thƣờng không ổn định nên tốt nhất là tiến hành hoạt hóa tinh trùng liền sau khi mang mẫu về phòng thí nghiệm.
Thao tác hoạt hóa và đếm các chỉ tiêu tinh trùng phải tiến hành nhanh và chính xác vì tinh trùng sau khi hoạt hóa rất dễ bị kết dính và thời gian sống không lâu, do đó sẽ ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả thụ tinh.
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
Bổ sung β-mercaptoethanol vào môi trƣờng nuôi trứng đã tăng tỷ lệ trứng chín: đạt 1,3% khi không bổ sung, 4,88% khi bổ sung 50 µM, và 1,65% khi bổ sung 100 µM.
Nhuộm trứng với nồng độ orcein 0,75% hay 1% không cho kết quả khác biệt về mặt thống kê. Tỷ lệ nhìn thấy rõ các giai đoạn của trứng khi nhuộm với nồng độ 0,75% là 21,64% và với nồng độ 1% là 28,19%.
Tỷ lệ trứng thụ tinh còn thấp, trong môi trƣờng Fert-TALP là 0,4% và trong môi trƣờng TYH là 0%.
5.2 Đề nghị
Nên bổ sung β-mercaptoethanol với nồng độ 50 µM vào môi trƣờng nuôi trứng. Nghiên cứu bổ sung EGF, huyết thanh chó đang lên giống với nồng độ thích hợp vào môi trƣờng nuôi trứng để tăng tỷ lệ trứng chín.
Dùng tinh trùng từ nhiều nguồn để đảm bảo nồng độ và hoạt lực tinh trùng nhằm cải thiện hiệu quả thụ tinh.
Bổ sung thành phần PHE stock (2µl/giọt) vào môi trƣờng thụ tinh.
Thử nghiệm quy trình tạo phôi chó bằng môi trƣờng TYH, trong đó TYH dùng cho tất cả các giai đoạn nuôi trứng, hoạt hóa tinh trùng, thụ tinh và nuôi phôi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997. Thụ tinh nhân tạo gia súc gia
cầm. NXB Nông Nghiệp Tp. Hồ Chí Minh.
2. Ngô Duy Bình, 2007. Khảo sát ảnh hưởng của EGF (epidermal growth factor)
lên sự trưởng thành của trứng bò in vitro. Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Khoa
Học Tự Nhiên TP.Hồ Chí Minh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3. Quách Hoa Thiên Cung, 2007. Tạo phôi bò bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống
nghiệm (in vitro fertilization-IVF). Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Khoa Học Tự
Nhiên TP.Hồ Chí Minh
4. Trần Thị Dân và Dƣơng Nguyên Khang, 2006. Sinh lý vật nuôi. NXB Nông Nghiệp
5. Phạm Thị Minh Đức, 2001. Sinh lý học, tập 2. NXB Y học Hà Nội
6. Nguyễn Thị Hà, 2007. Thử nghiệm tạo phôi dâu bằng kỹ thuật thụ tinh trong
ống nghiệm trên heo. Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.Hồ
Chí Minh
7. Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005. Khảo sát khả năng khai thác tinh trên chó và khả
năng bảo quản của một số môi trường pha chế tinh. Luận văn thạc sĩ, Đại học
Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
8. Đỗ Hoàng Khiêm, 2006. Một số yếu tố ảnh hưởng kết quả nuôi cấy tế bào biểu
mô ống dẫn trứng và phản ứng hoạt hóa tinht trùng chó. Khóa luận tốt nghiệp,
Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh hóa tinh
9. Nguyễn Quang Mai và Cù Xuân Dần, 2005. Sinh lý học vật nuôi. NXB Đại học
Sƣ Phạm Hà Nội
10.Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2006. Công nghệ sinh học người và động
vật. NXB Giáo Dục
11.Nguyễn Đình Nhung và Nguyễn Minh Tâm, 2005. Giáo trình giải phẩu sinh lý
12.Lâm Thị Ngọc Thanh, 2006. Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố sinh học lên chất lượng noãn chó trong điều kiện nuôi chín in vitro. Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh
13.Nguyễn Bạch Thảo Vy, 2005. Áp dụng quy trình nuôi chín noãn in vitro trên
heo và chó. Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
14.Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, 2005. Công nghệ sinh học, tập
2: Công nghệ sinh học tế bào. NXB Giáo Dục
Tài liệu tiếng Anh
15. Ada Rota and Giorgina Cabianca, 2004. In vitro maturation rates of canine oocytes from anestrous bitches in simple media. Reprod. Nutr. Dev. 44: 105-109 16. Berenice de Avila Rodrigues, Lucila Carboneiro Dos Santos and Jose Luiz Rodrigues, 2004. Embryonic development of in vitro matured and in vitro
fetilized dog oocytes. Molecular reproduction and development 67: 215-223. 17.Cole H.H. and Cupps, 1959. Reproduction in domestic animals. Academic
press, New York and London, pp. 342 – 345, 369 – 374.
18.Dela Pena E.C., Takahashi Y., Katagiri S., Atabay E.C. and Nagano M., 2002.
Birth of pups after transfer of mouse embryos derived from vitrified preantral follicles. Reproduction 123: 593-600 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
19.Downs S.M. and Hudson E.D., 2000. Energy subtrates and the completion of spontaneous meiotic maturation. Zygote, 8: 339 – 351.
20.Masaya Geshi and Naoki Takenouchi, 2000. Effects of sodium pyruvate in nonserum maturation medium on maturation fertilization, and subsequent development of bovine oocytes with or without cumulus cells. Biol. Reprod., 63: 1730 – 1734.
21.Matins L.R., Ponchirolli C.B., Beier S.L., Landim-Alvarenga F.C. and Lopes M.D., 2006. Analysis of nuclear maturation in in vitro matured oocytes from estrous and anestrous bitches. Anim. Reprod., v.3, n.l, p.49-54
22.Kim Kyu Min, Fibrianto Heru Yuda, Oh Ju Hyun, Jang Goo, Kim Jin Hye, Lee
Effects of estradiol-17β and progesteron supplementation on in vitro nuclear maturation of canine oocytes. Theriogenology 63 [Abstract].
23.Kim Kyu Min, Fibrianto Heru Yuda, Oh Ju Hyun, Jang Goo, Kim Jin Hye, Lee
Seung Kyu, Kang Keun Sung, Lee Chun Byeong and Hwang Suk Woo, 2004. Effect of β-mercaptoethanol or epidermal growth factor supplementation on in vitro maturation of canine oocytes collected from dogs with different stages of the estrus cycle. J. Vet. Sci5 (3): 253-258.
24.Otoi T., Fujii M., Tanaka M., Ooka A. and Suzuki T., 1999. Effects of serum on the in vitro maturation of canine oocytes. Reprod. Fertil. Dev., 11:387 – 390.
25.CuiXiang-Shun, Jin Yong-Xun, Shen Xing-Hui, Lee Jae-Yeong, Lee Hyo-Sang,
Yin Xi-Jun, Kong Il-Keun and Kim Nam-Hyung, 2006. Epidemal growth factor enhances meiotic resumption of canine oocytes in the presence of BSA.
Theriogenology66: 267-274.
26.Yamada S., Shimazu Y., Kawaji H., Nakazawa M., Naito K. and Toyoda Y., 1992. Maturation, fertilization, and development of dog oocyte in vitro. Biology of reproduction46: 853-858.
27.Jin Yong-Xun, Lee Hyo-Sang, Yin Xi-Jun, Cui Xiang-Shun, Kong Il-Keun and
Kim Nam-Hyung, 2006. Chromatin, microtubule and microfilament configurations in the canine oocyte. Reproduction, fertility and development 18: 849-856.
PHỤ LỤC
Thí nghiệm1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để nuôi chín trứng
One-Way Analysis of Variance
---
Data: MERCAPTO.Ty_le_chin
Level codes: MERCAPTO.Nong_do
Labels:
Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD
Analysis of variance
---
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --- Between groups .0077643 2 .0038821 4.582 .0193 Within groups .0228754 27 .0008472 --- Total (corrected) .0306396 29 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
0 missing value(s) have been excluded.
09/05/07 04:53:48 AM Page 1 Table of means for MERCAPTO.Ty_le_chin by MERCAPTO.Nong_do
---
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --- 1 10 .0129910 .0054492 .0092045 -.0003667 .0263487 2 10 .0487369 .0137292 .0092045 .0353792 .0620946 3 10 .0165003 .0059988 .0092045 .0031426 .0298580 --- Total 30 .0260761 .0053142 .0053142 .0183640 .0337881 09/05/07 04:54:08 AM Page 1 Multiple range analysis for MERCAPTO.Ty_le_chin by MERCAPTO.Nong_do
---
- Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--- - 1 10 .0129910 X 3 10 .0165003 X 2 10 .0487369 X --- - contrast difference limits
1 - 2 -0.03575 0.02672 *
1 - 3 -0.00351 0.02672
2 - 3 0.03224 0.02672 *
---
- * denotes a statistically significant difference.
Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng
09/05/04 06:08:23 PM Page 1
Table of means for ORCEIN.Ty_le_thay by ORCEIN.Nong_do
---
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --- 1 23 .2147045 .0328294 .0460050 .1498259 .2795831 2 50 .2781867 .0344688 .0312021 .2341839 .3221894 --- Total 73 .2581854 .0258231 .0258231 .2217685 .2946024 09/05/04 06:08:41 PM Page 1 Multiple range analysis for ORCEIN.Ty_le_thay by ORCEIN.Nong_do
---
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
---