3.5.6.1 Thu nhận trứng sau khi nuôi
Cho 200 µl hyaluronidase 0,1 % vào mỗi giọt nuôi, để trong 15 phút
Hút nhiều lần bằng pipette Pasteur để làm
bong lớp tế bào cumulus bao quanhtrứng
Chuyển trứng qua PBS-PVA rửa 3 lần
Đánh giá, phân loại trứng
Trứng loại A Trứng loại B Trứng loại C
3.5.6.2 Đánh giá trứng sau khi nuôi
Đánh giá mức độ giãn nở của lớp tế bào cumulus, đây là một tín hiệu kiểu hình giúp ta biết gián tiếp về mức độ trƣởng thành của trứng. Các mức độ phát triển của tế bào cumulus:
Lớp tế bào cumulus không giãn nở
Lớp tế bào cumulus chỉ giãn nở lớp ngoài cùng
Lớp tế bào cumulus giãn nở hơn một nửa số lớp tế bào bao quanh trứng
Lớp tế bào cumulus giãn nở hoàn toàn
Đánh giá sự trƣởng thành của nhân (quan sát thể cực) và sự trƣởng thành của tế bào chất: Trứng xấu Trứng tốt Trứng chín -Là những trứng thoái hóa -Tế bào chất không đồng nhất bị co cụm hoặc phân tán.
-Không xuất hiện thể cực thứ nhất.
-Là những trứng chƣa chín
-Tế bào chất đồng nhất, chiếm hết xoang tế bào. -Không xuất hiện thể cực thứ nhất.
-Là những trứng trƣởng thành
-Tế bào chất đồng nhất, chiếm hết xoang tế bào. -Xuất hiện thể cực thứ nhất.
Trứng xấu Hình 3.6. Phân loại trứng sau khi nuôi
Những trứng có lớp tế bào cumulus giãn nở, có sự trƣởng thành về nhân và tế bào chất là những trứng đƣợc chọn cho thụ tinh in vitro.
3.5.7 Nhuộm trứng
Hình 3.7. Sự giãn nở của tế bào cumulus
Đậy lamel với 4 góc đã đƣợc bôi ít silicone lên lame và ép xuống nhẹ nhàng, để khô khoảng 30 phút
Ngâm lame trong dung dịch ethanol:acid acetic tỷ lệ 3:1 (v/v) trong 48 giờ
Dùng giấy thấm hết dung dịch cũ ra và dùng pipette Pasteur đẩy từ từ acetone vào, để 15 phút
Rút acetone ra và thay thế bằng aceto-orcein, để khoảng 30 phút
Rút hết aceto-orcein và thay bằng dung dịch aceto-glycerol cho tới khi trứng nhạt màu
Cố định bằng keo dán. Quan sát dƣới kính hiển vi
Chuyển trứng đã đƣợc làm sạch tế bào cumulus với một ít PBS-PVA lên lame
Lưu ý: trong quá trình nhuộm không đƣợc để cho trứng bị khô vì khi đó trứng rất dễ bị biến dạng và bẳt màu không đẹp.
3.5.8 Thu nhận tinh hoàn tại lò mổ
Thời điểm lấy mẫu: khi chó vừa mới bị đập chết, chƣa qua giai đoạn xử lý nhiệt. Chọn chó đực lấy mẫu: những chó có tinh hoàn lộ rõ ra ngoài, kích thƣớc lớn. Lấy mẫu: dùng dao mổ cắt dọc giữa bìu để lộ tinh hoàn ra ngoài, ta lấy luôn cả tinh hoàn và phó tinh hoàn.
Trữ mẫu: trong dung dịch NaCl 0,9 % và mang nhanh về phòng thí nghiệm.
3.5.9 Thu tinh trùng và hoạt hóa tinh trùng
3.5.9.1 Quy trình thu nhận và hoạt hóa tinh trùng (phƣơng pháp Swim-up)
Ủ ấm sẵn ống falcon có chứa 1,5 ml Sperm-TALP-1 hoặc TYH trong tủ CO2.
Cắt phần đuôi phó tinh hoàn trong 2 ml Tris-glucose hoặc TYH để giải phóng tinh trùng
Dùng micropipette hút 1 ml dịch tinh trùng cho vào nhẹ nhàng xuống đáy ống falcon đã đƣợc ủ ấm. Phần dịch còn lại đƣợc dùng để đếm hoạt lực và nồng độ.
Mở nắp ống falcon và đặt nghiêng 30o
trong tủ ấm 5 % CO2, 37oC trong 60 phút.
Lấy ống falcon ra, hút 1 ml dịch tinh trùng nằm phía trên cho vào ống khác, trộn đều nhẹ nhàng, đếm hoạt lực, nồng độ và tỷ lệ tinh tinh trùng sống. Nếu các chỉ tiêu đảm bảo thì tiến hành thụ tinh.
Nếu nồng độ chƣa đủ thì ly tâm (600 vòng/5 phút). Thu phần đáy và kiểm tra lại các chỉ tiêu.
3.5.9.2 Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu đánh giá tinh trùng trong thụ tinh in vitro
a) Xác định hoạt lực tinh trùng
Tiến hành: dùng đũa thủy tinh lấy một giọt tinh đặt lên phiến kính sạch khô, đậy lá kính lên mẫu tinh này và xem ở vật kính 10 và 40.
Nhằm phản ánh hoạt động tối ƣu của tinh trùng, đặt tinh trùng ở 37O
C khi kiểm tra hoạt lực. Có 3 loại vận động đƣợc quan sát: vận động tiến thẳng, vận động
vòng quanh và vận động lắc lƣ. Đánh giá hoạt lực của tinh trùng dựa trên tỉ lệ tinh trùng tiến thẳng và cho điểm từ 0 - 1.
b) Xác định nồng độ tinh trùng
Tiến hành: xác định nồng độ tinh trùng bằng buồng đếm hồng cầu với độ pha loãng 200 lần.
Nồng độ tinh trùng: C = n * b * 50.000 Trong đó:
C : Nồng độ tinh trùng trong 1 ml dịch từ đuôi phó tinh hoàn đƣợc pha loãng với 2 ml môi trƣờng tris – glucose hay TYH
n : Số lƣợng tinh trùng đếm đƣợc trong 5 ô lớn b : Hệ số pha loãng
Nồng độ tinh trùng tối ƣu cho thụ tinh in vitro trong môi trƣờng Fert-TALP là 2,5.107
tế bào/ml (theo Kim et.al., 2005) và 107 tế bào/ml trong môi trƣờng TYH (theo Yamada et.al., 1992).
c) Xác định tỷ lệ tinh trùng sống/chết
Tiến hành:
Trộn đều 1 giọt tinh dịch với 2 giọt eosin 1 % và để 30 giây. Cho thêm 3 giọt nigrosin 10 % rồi trộn đều và để tiếp 30 giây.
Đặt 1 giọt mẫu vừa nhuộm xong lên lame và trải thành lớp mỏng Để mẫu khô tự nhiên
Quan sát tinh trùng dƣới kính hiển vi (vật kính 10) Tinh trùng sống: không bắt màu
Tinh trùng chết: bắt màu hồng
Kiểm tra tổng số 100 tinh trùng, suy ra tỷ lệ % tinh trùng sống. Nếu tỷ lệ tinh trùng sống đạt 80 % trở lên thì mẫu tinh trùng đó tốt.
3.5.10 Phƣơng pháp thụ tinh
Những trứng dùng trong thụ tinh là những trứng sau 72 giờ nuôi đƣợc đánh giá tốt (nội chất đồng đều, lớp tế bào cumulus giãn rộng) bằng cách nhìn nhanh trên kính hiển vi, không qua giai đoạn nhuộm.
3.5.10.1 Thụ tinh bằng môi trƣờng Fert-TALP (Kim et.al., 2006)
Chuẩn bị vi giọt môi trƣờng Fert-TALP (44 µl/giọt) trong đĩa petri, phủ dầu khoáng và đƣợc ủ ấm.
Hút trứng đã đƣợc nuôi 72 giờ ra khỏi giọt nuôi, rửa 3 lần trong Sperm-TALP. Chuyển trứng vào vi giọt đã đƣợc ủ ấm, 10 COCs/giọt.
Hút 2 µl tinh trùng đã đƣợc hoạt hóa (nồng độ 2,5.107 tế bào/ml) cho vào mỗi giọt thụ tinh.
Tiếp theo cho 2 µl heparin vào từng giọt thụ tinh.
Cho đĩa thụ tinh vào tủ ấm 5%CO2, 37oC và nuôi trong 24 giờ. Sau 24
giờ Trứng trƣởng thành
Rửa trứng 2-3 lần trong môi trƣờng thụ tinh
Tạo vi giọt: 10 COCs/giọt, ủ ấm
Tinh trùng
Hoạt hóa tinh trùng (phƣơng pháp Swim-up)
Đánh giá các chỉ tiêu IVF: bơm tinh trùng
vào vi giọt
Cho đĩa thụ tinh vào ủ ấm: 5 % CO2, 37oC
Nhuộm trứng để đánh giá sự hình thành tiền nhân
3.5.10.2 Thụ tinh bằng môi trƣờng TYH (Yamada et.al., 1992)
Chuẩn bị vi giọt môi trƣờng TYH (100 µl/giọt) trong đĩa petri, phủ dầu khoáng và ủ ấm.
Hút trứng đã đƣợc nuôi 72 giờ ra khỏi giọt nuôi, rửa 3 lần trong TYH. Chuyển trứng vào vi giọt đã đƣợc ủ ấm, 10 COCs/giọt.
Hút 10 µl tinh trùng đã đƣợc hoạt hóa (nồng độ 107 tế bào/ml) cho vào mỗi giọt thụ tinh.
Cho đĩa thụ tinh vào tủ ấm 5 % CO2, 37oC và nuôi trong 24 giờ.
3.6 Xử lý số liệu
Xử lý thống kê bằng trắc nghiệm ANOVA sau khi chuyển dạng arcsin ở phần mềm Stagraphic 7.0. Kết quả đƣợc trình bày dƣới dạng X ± SE.
Chƣơng 4
KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để nuôi chín trứng
β-mercaptoethanol có vai trò cải thiện tỷ lệ chín trứng và phát triển phôi ở một số loài động vật, vì nó có vai trò gián tiếp trong việc tổng hợp glutathione (GSH) - một hợp chất quan trọng bảo vệ tế bào khỏi các tác nhân oxy hóa.
Thí nghiệm bổ sung 3 nồng độ β-mercaptoethanol khác nhau (0 µM, 50 µM và 100 µM) vào môi trƣờng nuôi trứng.
Bảng 4.1 Tỷ lệ trứng chín với các nồng độ β-mercaptoethanol Nồng độ β-mercaptoethanol ( µM) Số lô Số trứng nuôi Tỷ lệ trứng chín (%) P 0 10 249 1,3 ± 0,54a 0,02 50 10 259 4,88 ± 1,37b 100 10 255 1,65 ± 0,6a 1.3 4.88 1.65 0 1 2 3 4 5 6 0 50 100 nồng độ β-mercaptoethanol ( µM) tỷ lệ tr ứ ng c hí n (% )
Từ kết quả trên cho thấy tỷ lệ trứng chín ở trƣờng hợp đối chứng với trƣờng hợp bổ sung 50 µM và 100 µM có sự khác biệt về mặt thống kê (p<0,05). Khi bổ sung ở nồng độ 50 µM là có sự khác biệt rõ nhất. Trung bình là 1,3% ở mẫu đối
chứng, 4,88% trong trƣờng hợp bổ sung 50 µM và 1,65% trong trƣờng hợp bổ sung
100 µM.
Tỷ lệ trứng chín ở hai nghiệm thức bổ sung β-mercaptoethanol cao hơn nghiệm thức đối chứng, nên β-mercaptoethanol có vai trò cải thiện tỷ lệ trứng chín mà tốt nhất là ở nồng độ 50 µM. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Kim (2004), tác giả đã báo cáo tỷ lệ trứng chín đạt 20% khi bổ sung 50 µM β- mercaptoethanol và đạt tỷ lệ cao hơn so với các nồng độ khác.
β-mercaptoethanol đóng vai trò nhƣ một chất đồng xúc tác, giúp tăng cƣờng tổng hợp glutathione (GSH) nội bào, mà GSH có vai trò phân hủy các chất oxy hóa trong môi trƣờng, tăng cƣờng vận chuyển amino acid và đẩy mạnh quá trình tổng hợp DNA, protein trong tế bào,…(Kim et.al., 2004). Do đó, trứng sẽ phát triển tốt và đạt tỷ lệ chín cao hơn đối chứng. Nhƣng nếu nồng độ GSH quá cao cũng sẽ làm mất cân bằng thành phần của các chất trong môi trƣờng nội bào, gây ảnh hƣởng xấu đến sự phát triển của trứng. Do vậy, khi bổ sung β-mercaptoethanol với nồng độ 100 µM đã cho tỷ lệ trứng chín thấp hơn so với 50 µM.
Kết quả của chúng tôi thấp hơn của Kim (2004), có thể do ảnh hƣởng của rất nhiều yếu tố trong quá trình nuôi trứng. Trứng đƣợc lấy từ chó cái ở nhiều giai đoạn sinh sản khác nhau, nên chất lƣợng trứng không đồng nhất, và có thể là do sự nhiễm khuẩn trong quá trình nuôi cấy làm ảnh hƣởng xấu đến sự phát triển của trứng. Nhiễm khuẩn là vấn đề rất khó giải quyết. Trong đề tài này, chúng tôi phải dùng hóa chất tự pha chứ không có nguồn hóa chất tổng hợp nên rất khó kiểm soát. Mặt khác, nguồn mẫu đƣợc lấy trực tiếp từ lò mổ nên nguy cơ nhiễm là rất cao.
4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng
Hiện nay, để xác định các giai đoạn phát triển của nhiễm sắc thể, hầu hết các nhà khoa học đều nhuộm huỳnh quang với Hoechst 33342 cho kết quả rất khả quan.
Tuy nhiên, do thực tế chúng tôi không có điều kiện nhuộm huỳnh quang, nên chỉ có thể xác định tỷ lệ trứng chín bằng orcein, và thí nghiệm đã tiến hành thử trên 2 nồng độ orcein khác nhau: 1% và 0,75%.
Bảng 4.2. Tỷ lệ trứng đƣợc nhìn rõ các giai đoạn theo nồng độ orcein
Từ kết quả trên cho thấy không có sự khác biệt về mặt thống kê (p>0,05) giữa nồng độ orcein 0,75% và nồng độ 1%. Trung bình là 21,64% ở nồng độ 0,75% và 28,19% ở nồng độ 1%. Nhƣ thế, có thể sử dụng nồng độ nào cũng không ảnh hƣởng nhiều tới khả năng bắt màu nhiễm sắc thể của orcein.
Tuy nhiên, điều đáng nói ở đây là tỷ lệ nhìn thấy rõ các giai đoạn nhiễm sắc thể quá thấp, điều này sẽ gây sai lệch trong việc đánh giá tỷ lệ trứng chín để làm cơ sở cho quá trình thụ tinh. Các yếu tố gây ảnh hƣởng có thể là:
Nồng độ orcein
(%) Số lô Số trứng nhuộm Tỷ lệ trứng nhìn rõ các giai đoạn
(%) P 0,75 23 437 21,64 ± 3,28 0,26 1 50 975 28,19 ± 3,45 21.64 28.19 0 5 10 15 20 25 30 0,75 1 nồng độ orcein (%) tỷ l ệ tr ứ n g n h ìn r õ c ác g ia i đ o ạn ( % )
Kinh nghiệm của ngƣời thao tác: tất cả các khâu của quá trình nhuộm trứng đều thủ công, do đó kinh nghiệm là một yếu tố rất quan trọng để giữ trứng không bị thất lạc trong quá trình thao tác và ngâm trong dung dịch acetic-ethanol.
Orcein để thời gian lâu có thể bị lắng, do đó làm giảm khả năng bắt màu nhiễm sắc thể, hoặc để lâu nên acetic và ethanol có thể bay hơi làm sai lệch nồng độ.
Hình 4.2 . Trứng nhuộm orcein không nhìn thấy rõ giai đoạn
GV GVBD
GV
MI MII
4.3Thí nghiệm 3: So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trƣờng TYH và Fert- TALP
Yamada et. al (1992) đã khảo sát tỷ lệ xuất hiện tiền nhân đực sau 12 giờ thụ tinh là 37% trong môi trƣờng TYH. Kim et.al (2006) đã khảo sát tỷ lệ xuất hiện tiền nhân sau 20 giờ thụ tinh là 28% trong môi trƣờng Fert-TALP.
Trong đề tài này chúng tôi đã tiến hành thử nghiêm thụ tinh trong cả hai môi trƣờng trên, sau 24 giờ thụ tinh thì tiến hành nhuộm bằng orcein để quan sát sự hình thành tiền nhân.
Bảng 4.3. Tỷ lệ hình thành tiền nhân trong TYH và Fert-TALP
Từ kết quả trên cho thấy tỷ lệ hình thành tiền nhân trong thí nghiệm rất thấp so với kết quả của Yamada et. al (1992) và Kim et. al (2006). Trong môi trƣờng TYH không có kết quả tạo thành tiền nhân, còn khi dùng môi trƣờng Fert-TALP thì chỉ có một tiền nhân duy nhất đƣợc hình thành. Tuy nhiên cũng có thể nói rằng môi trƣờng Fert-TALP dùng trong quy trình này tƣơng đối phù hợp hơn môi trƣờng TYH.
Môi trƣờng
thụ tinh Số lô Số trứng thụ tinh Số trứng đạt
tiền nhân
Tỷ lệ (%)
Fert-TALP 15 252 1 0,4
TYH 12 213 0 0
Một số nguyên nhân có thể làm cho tỷ lệ thụ tinh thấp:
Tỷ lệ trứng chín thấp.
Lớp lipid trong nội chất của trứng chó nhiều do đó rất khó quan sát đƣợc
thể cực sau 72 giờ nuôi nên hầu hết trứng sau khi nuôi đƣợc đánh giá theo kinh nghiệm và mang đi thụ tinh.
Thí nghiệm nhuộm trứng bằng orcein vẫn chƣa đạt tỷ lệ cao, do đó việc đánh giá tỷ lệ trứng chín chƣa đƣợc chính xác, điều này gây khó khăn cho việc bổ sung các chất khác (β-mercaptoethanol, EGF…) vào môi trƣờng để tăng hiệu quả chín trứng.
Tinh trùng trong thí nghiệm lấy trực tiếp từ phần đuôi phó tinh hoàn của những chó đực từ lò mổ nên chất lƣợng tinh trùng không ổn định (nồng độ và hoạt lực), có thể là do chó đực bị nhốt một vài ngày trƣớc khi mổ nên dễ bị stress, ngoài ra trong thời gian đó chó còn bị bỏ đói… đã ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng sinh tinh và chất lƣợng của tinh trùng. Do đó mà nồng độ và hoạt lực tinh trùng sau khi hoat hóa thƣờng không cao và có khi thấp hơn nồng độ cần cho thụ tinh rất nhiều.
Trong môi trƣờng thụ tinh của chúng tôi thiếu thành phần PHE stock so với môi trƣờng thụ tinh của Kim et.al. (2006), vì trong PHE stock có hypotaurine là yếu tố bảo vệ áp suất thẩm thấu trong môi trƣờng.
Điều kiện thí nghiệm của chúng tôi chƣa đạt điều kiện vô trùng nên rất dễ bị tạp nhiễm trong thao tác.
4.4 Một số kinh nghiệm trong IVF 4.4.1 Lấy mẫu 4.4.1 Lấy mẫu
Đặc tính sinh lý sinh sản của chó rất khác với những loài khác. Do đó, tỷ lệ trứng chín trong IVM và hình thành phôi trong IVF rất thấp. Mặt khác, theo khảo sát của Lâm Thị Ngọc Thanh (2006), tỷ lệ trứng thu đƣợc và tỷ lệ trứng chín cao nhất ở giai đoạn xoang nang, do đó nên chọn những chó trong giai đoạn động dục hoặc trƣớc động dục.
Chó đực phải có tinh hoàn lớn nhằm đảm bảo nồng độ và hoạt lực tinh trùng cho thụ tinh.
Dung dịch trữ mẫu phải đƣợc bổ sung kháng sinh vào mỗi ngày lấy mẫu để hạn chế sự nhiễm khuẩn.
Mẫu sau khi lấy phải đƣợc vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm càng