2.6.1 Lịch sử IVF
Sau khi IVM thành công trên một số loài thì các nhà khoa học trên thế giới tiếp tục nghiên cứu về kỹ thuật IVF. IVF đã thành công trên rất nhiều loài động vật nhƣ chó, heo, thỏ, bò…Kỹ thuật ra đời đã mang lại một ý nghĩa to lớn trong việc giải quyết vấn đề vô sinh ở ngƣời.
Năm 1959, con thỏ đầu tiên ra đời từ phƣơng pháp thụ tinh trong ống nghiệm Năm 1972, con chuột đầu tiên ra đời từ phôi đông lạnh.
Ngày 25 tháng 7 năm 1978, lần đầu tiên trong lịch sử nhân loại, bé gái Louise Brown ra đời bằng công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm tại một bệnh viện ở Anh.
Năm 1982, bé gái thứ hai Amadine ra đời bằng công nghệ này ở Pháp.
Những năm 80 của thế kỷ XX, kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm phát triển mạnh. Singapore đƣợc ghi nhận là nơi thực hiện thành công thụ tinh trong ống nghiệm đàu tiên ở châu Á vào năm 1983
Năm 1984, một phôi đông lạnh đƣợc rã đông để cấy vào tử cung, đã cho ra đời bé trai đầu tiên là Zoe.
Năm 1986, Cheng và ctv đã thành công IVF heo
Năm 1990, Gordon và Lu đã tạo thành công phôi bò IVF Năm 1992, Yamada và ctv đã tạo phôi chó thành công Năm 1994, Madan và ctv đã tạo thành công phôi trâu IVF Năm 2006, Kim và ctv thành công IVF trên chó.
Ở Việt Nam: Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM đã thành công trên bò, chuột và heo. Thụ tinh nhân tạo thành công trên ngƣời ở bệnh viện Từ Dũ, Hùng Vƣơng.
2.6.2 Cơ chế của sự thụ tinh (Phạm Thị Minh Đức và ctv, 2001)
Khi còn trong tinh dịch, một lƣợng lớn cholesterol bọc quanh đầu tinh trùng, tạo thành màng bao bọc quanh đầu bền vững và ngăn chặn sự giải phóng enzyme. Khi di chuyển trong đƣờng sinh dục cái lớp cholesterol bị mất, màng tinh trùng yếu và tăng tính hấp thụ đối với Ca2+
, Ca2+ cao trong bào tƣơng của đầu tinh trùng làm tăng vận động của tinh trùng và giải phóng enzyme.
Đầu tinh trùng dự trữ lƣợng lớn hyaluronidase và enzyme thủy phân protein. Hyaluronidase phá hủy liên kết các tế bào hạt quanh noãn, sau đó nhờ enzyme phân giải protein mà tinh trùng có thể chọc thủng màng trong suốt của noãn và tiếp cận với lớp vỏ bao quanh noãn. Tại đây có các thụ thể cố định màng trƣớc của tinh trùng vào lớp vỏ noãn, màng trƣớc tinh trùng bị tiêu đi, giải phóng enzyme và mở đƣờng xâm nhập vào lòng noãn, màng trong đầu tinh trùng tan ra và vật chất di truyền của đầu tinh trùng xâm nhập vào noãn.
Hình 2.4. Các giai đoạn xâm nhập của tinh trùng vào trứng (Nguồn: Naokazu et.al., 2005)
2.6.3 Các giai đoạn phát triển của phôi
Quá trình thụ tinh hoàn tất dẫn đến quá trình hình thành phôi ở dạng một tế bào. Sau đó, phôi bắt đầu phân chia thành dạng 2, 4, 8, và 16 tế bào (tế bào nguyên phôi-blastomer). Các blastomer này ngày càng đƣợc phân chia nhiều hơn, nhỏ hơn và kết hợp lại thành khối rắn chắc đƣợc gọi là phôi dâu (morula), lúc này rất khó nhìn thấy từng tế bào trong phôi, khối tế bào chiếm gần hết không gian của trứng. Sau đó, phôi tiếp tục phát triển hình thành dạng phôi nang (blastocyst) và có sự tích lũy chất dịch bên trong tạo khối cầu rỗng. Tiếp đó, blastocyst qua giai đoạn phôi nang trƣơng nở (expanded blastocyst) và thoát khỏi màng trong suốt ở giai đoạn thoát nang (hatching blastocyst) rồi bắt đầu làm tổ trong tử cung.
2.6.4 Vật liệu cho IVF (Phan Kim Ngọc, 2006)
2.6.4.1 Giao tử
Trứng (noãn) dùng cho thụ tinh in vitro thƣờng có thể ở 3 dạng: trứng non, trƣởng thành và hậu trƣởng thành. Tùy mức độ phát triển của trứng mà tiến hành các thao tác tiền xử lý khác nhau, thông qua việc nuôi trong khoảng thời gian nhất định trƣớc khi thụ tinh.
Các tinh trùng dùng cho thụ tinh in vitro đƣợc chuẩn bị theo một số phƣơng pháp: swim up, tạo vón cục kết hợp swim up, ly tâm, lắng… nhằm làm tăng nồng độ và khả năng hoạt động của tinh trùng. Nồng độ tinh trùng đƣợc quyết định do số lƣợng tinh trùng và dung tích của vi giọt môi trƣờng thụ tinh.
Thƣờng thì nồng độ tinh trùng trong giọt thụ tinh là 105 tinh trùng bình thƣờng/ml, nếu các tinh trùng thiếu các tiêu chuẩn về độ di động và hình thái thì nồng độ thụ tinh phải cao hơn. Nồng độ tinh trùng dƣới 5.104/ml thì kết quả IVF không tốt, tuy nhiên nếu nồng độ tinh trùng quá cao cũng không thuận lợi cho IVF vì sẽ tăng khả năng đa bội, thậm chí sẽ ảnh hƣởng khả năng sống sót của phôi bởi các enzyme trong đầu cực tinh trùng có hại cho trứng và phôi, mẫu tinh trùng chết có thể gây tổn thƣơng cho trứng vì các gốc oxy tự do.
2.6.4.2 Môi trƣờng IVF
Thông thƣờng môi trƣờng nuôi trứng còn đƣợc sử dụng cho giai đoạn thụ tinh, thậm chí còn cho cả giai đoạn hình thành và phát triển phôi sau này. Tuy nhiên hiệu quả này không rõ ràng.
Trong các môi trƣờng thụ tinh in vitro, có 3 nhóm chất cần thiết cho sự hoạt động của tinh trùng: muối, cơ chất năng lƣợng (pyruvate, glucose, lactate), và nguồn protein. Ion Ca2+, bicarbonat, tỷ lệ Na+
/K+ gần giống trong dịch ống dẫn trứng. Ca2+ cần thiết cho phản ứng cực đầu và thúc đẩy cho các cơ chế sinh học khác tiến triển. Đƣờng glucose, lactate là nguồn năng lƣợng ngoại sinh của tinh trùng. Protein, đặc biệt là albumin thúc đẩy khả năng vận chuyển và tăng cƣờng hoạt hóa.
và phát triển ban đầu của phôi. Ở môi trƣờng acid phôi phát triển kém.
Hệ đệm bicarbonat đƣợc dùng để ổn định pH vì khi ủ kín các tế bào hô hấp sẽ tạo CO2 làm tăng tính acid của môi trƣờng, sự kết hợp giữa hệ đệm này cùng với CO2 trong tủ ấm sẽ giúp ổn định pH cho tế bào.
Khi thụ tinh hoặc nuôi phôi in vitro phải phủ lên bề mặt môi trƣờng một lớp dầu khoáng để làm giảm quá trình tạo hạt ngƣng tụ trong môi trƣờng và sự thay đổi nồng độ các chất. Ngoài ra, dầu khoáng còn có tác dụng ngăn cản sự xâm nhập của bụi và vi sinh vật từ ngoài. Tuy nhiên, nó ngăn cản sự khuyếch tán của CO2 vào môi trƣờng nuôi.
2.6.5 Các hệ thống thụ tinh in vitro(Phan Kim Ngọc, 2006)
Có 3 yếu tố quan trọng trong một hệ thống thụ tinh in vitro: dụng cụ thụ tinh, môi trƣờng thụ tinh và các điều kiện khác (khí, nhiệt độ, độ ẩm môi trƣờng…)
Thụ tinh trong ống nghiệm 5 ml:
Thích hợp nhất là ống ly tâm nhựa 5 ml với nắp mở đƣợc vặn lỏng, giúp kiểm soát tốt pH và áp suất thẩm thấu. Thông thƣờng, tỷ lệ thụ tinh tối ƣu là 1 phức hợp trứng với tế bào cumulus (cumulus oocyte complex-COC)/ ống nghiệm trong 0,5 ml môi trƣờng và 5.104 tinh trùng di động.
Thụ tinh trong đĩa một hay bốn giếng:
Thêm một thể tích huyền phù đã đo trƣớc vào mỗi giếng với nồng độ trung bình là 105 tinh trùng di động/giếng. Sự gắn tinh trùng vào màng trong suốt xảy ra sau 1-3 giờ thụ tinh, do đó sau 3h trứng có thể đƣợc rửa lại để loại bỏ tinh trùng thừa.
Thụ tinh trong ống mao quản và cọng rạ:
Ƣu điểm là tiết kiệm trứng cũng nhƣ tinh trùng. Phƣơng pháp này còn đƣợc gọi là nuôi cấy trong âm đạo.
Tỷ lệ thụ tinh tốt nhất đạt đƣợc trong các ống mao quản và cọng rạ với thể tích 5-10 µl chứa 2000-4000 tinh trùng di động.
Huyền phù trứng/tinh trùng trong cọng rạ đƣợc bảo vệ bằng các khoảng môi trƣờng, ngăn cách xen kẽ với các bóng không khí, đƣợc đặt nằm ngang trong tủ ấm
37oC và 5% CO2. Sau thụ tinh, dùng pipet đẩy hết dung dịch trong ống vào đĩa để kiểm tra.
Thụ tinh trong vi giọt:
Đây là phƣơng pháp IVF phổ biến nhất. Đƣa các COC vào một vi giọt đã đƣợc chuẩn bị sẵn từ 20-50 µl huyền phù tinh trùng dƣới lớp dầu. Thuận lợi của phƣơng pháp này là kiểm soát tốt pH và áp suất thẩm thấu bởi thể tích nhỏ và số lƣợng tinh trùng ít, rất phù hợp cho những trƣờng hợp mẫu ít tinh trùng.
Trên chó, thể tích vi giọt dùng cho thụ tinh in vitro tùy thuộc vào loại môi trƣờng, nhƣ thể tích 50 µl/giọt đối với môi trƣờng Fert-TALP (Kim et.al., 2006), thể tích 100 µl/giọt đối với môi trƣờng TYH (Yamada et.al., 1992).
2.6.6 Đánh giá kết quả thụ tinh (Phan Kim Ngọc, 2006)
Có thể ghi nhận và đánh giá kết quả sau 24 giờ thụ tinh bằng quan sát kính hiển vi và có thể tiến hành phẩu tích phôi, có thể dùng enzyme hay cơ học để tách bỏ lớp tế bào cumulus xung quanh để dễ quan sát và đánh giá.
Đánh giá trứng thụ tinh cũng đƣợc dựa vào hai chỉ tiêu cơ bản, đó là sự thay đổi của nhân và tế bào chất.
Đạt được các tiền nhân
Những trứng thụ tinh tốt là những trứng đƣợc quan sát thấy 2 tiền nhân và 2 thể cực.
Trạng thái của tế bào chất
Biểu hiện hình dạng đặc thù với màng trong suốt đầy đặn và nguyên sinh chất sạch. Ngoài ra cũng có thể quan sát thêm: nguyên sinh chất của tế bào luôn có ít hạt, có thể biểu hiện từ màu nâu đến đen, hình dạng của trứng có thể biến đổi từ hình cầu đến những hình dạng không đặc trƣng, một vành sáng rõ nguyên sinh chất ngoại vi là một bằng chứng về sự hoạt hóa tốt và sự bắt đầu cho một chu kỳ tiếp theo của quá trình phân bào.
Tuy nhiên, không phải tất cả các trứng đều đƣợc thụ tinh trong ngày đầu tiên, các trứng không xuất hiện tiền nhân có thể đƣợc tái thụ tinh. Sự thụ tinh hay phân cắt thƣờng đƣợc xác nhận vào ngày thứ hai, đó có thể là kết quả thụ tinh của lần
đầu, hoặc có thể là sự chậm trễ thụ tinh do các khiếm khuyết chức năng tinh trùng hay sự trƣởng thành trễ của trứng.
2.6.7 Các yếu tố ảnh hƣởng đến IVF
Sự trƣởng thành của trứng: trứng chỉ đƣợc thụ tinh khi đạt đến MII, do đó sự trƣởng thành của trứng trong IVM là một cơ sở rất quan trọng cho tỷ lệ thành công trong IVF. Đa số các loài động vật, khi rụng trứng đã đạt đến MII nhƣng ở chó trứng rụng khi còn ở giai đoạn GV, do vậy đây là một trở ngại rất lớn làm cho tỷ lệ trứng chín trong IVM và tỷ lệ tạo phôi trong IVF ở chó rất thấp.
Năng lực của tinh trùng: hoạt lực của tinh trùng là một yếu tố cực kỳ quan trọng quyết định khả năng xâm nhập của tinh trùng vào màng trong suốt và kết hợp với nhân cái để tạo thành tiền nhân.
Nồng độ tinh trùng trong giọt thụ tinh: nồng độ tinh trùng trong giọt thụ tinh là một yếu tố rất cần thiết trong IVF. Tinh trùng sẽ tiết enzyme hyaluronidase để phá hủy mối liên kết giữa các tế bào cumulus bao quanh trứng nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho sự xâm nhập của tinh trùng vào bên trong. Nhƣng để quá trình đó diễn ra thì phải có đủ lƣợng enzyme hyaluronidase, do đó nồng độ tinh trùng là yếu tố cần thiết, nhƣng nồng độ tinh trùng cũng không đƣợc quá cao vì sẽ gây ảnh hƣởng xấu cho sự phát triển của trứng và làm giảm tỷ lệ thụ tinh.
Môi trƣờng IVF: có nhiều loại môi trƣờng IVF khác nhau và phù hợp cho từng loài động vật, nhƣ môi trƣờng NCSU 23 dùng cho heo, môi trƣờng TYH và Fert-TALP dùng cho chó.
Kỹ thuật của ngƣời thao tác: trong kỹ thuật IVF tất cả mọi quá trình đều có sự tham gia trực tiếp của ngƣời thao tác do đó để góp phần vào tỷ lệ thành công trong IVF thì trƣớc hết ngƣời thao tác phải có kinh nghiệm, sự tỷ mỉ và chính xác trong công việc. Mặc khác, thao tác cũng là một khâu rất dễ xảy ra sự tạp nhiễm từ các nguồn bên ngoài mà đó là một vấn đề rất khó khăn và phức tạp trong khâu giải quyết, làm giảm đáng kể tỷ lệ thành công.
Chƣơng 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành
Thời gian: từ 1/3/2007 đến 15/8/2007
Địa điểm: phòng Nuôi cấy tế bào và phòng thí nghiệm Sinh Lý Sinh Hóa khoa Chăn Nuôi Thú Y
3.2 Nội dung nghiên cứu
Cải thiện quy trình nuôi chín trứng và nhuộm trứng để xác định các giai đoạn phát triển của trứng
So sánh hiệu quả thụ tinh giữa hai môi trƣờng TYH và Fert-TALP.
3.3 Vật liệu 3.3.1 Nguồn mẫu 3.3.1 Nguồn mẫu
Trứng từ buồng trứng đƣợc lấy ở lò mổ
Tinh trùng từ phần đuôi phó tinh hoàn đƣợc lấy ở lò mổ
3.3.2 Hóa chất
3.3.2.1 Hóa chất dùng cho trứng a) Môi trƣờng bảo quản buồng trứng a) Môi trƣờng bảo quản buồng trứng
Thành phần môi trƣờng phosphate buffered saline (PBS):
Nƣớc cất 100 ml NaCl 800 mg KCl 20 mg Na2HPO4.12H2O 290 mg KH2PO4 20 mg Penicillin 7,5 mg Gentamycin 5 mg b) Môi trƣờng cắt trứng
Thành phần môi trƣờng HEPES-buffered-Tyrodes (HEPES-TL-PVA):
NaCl 129 mM Hepes/KOH 10 mM KH2PO4 0,8 mM MgCl2 0,8 mM D-glucose 5,6 mM NaHCO3 0,8 mM CaCl2 1 mM
Hình 3.2. Tinh hoàn Hình 3.3. Phó tinh hoàn
PVA 0,1 % (w/v)
c) Môi trƣờng nuôi trứng
Thành phần môi trƣờng North Carolina State University 37 (NCSU 37):
NaCl 108,73 mM NaHCO3 25,07 mM KCl 4,78 mM KH2PO4 1,19 mM MgSO4.7H2O 1,19 mM CaCl2.2H2O 1,7 mM Glucose 5,55 mM Penicillin G 0,18 mM Streptomycin sulphate 39 mM D-sorbitol 5,55 mM
Bovine serum albumine (BSA) 0,4 % (w/v)
Bổ sung:
Follicle stimulating hormone (FSH) 1 µg/ml
Human gonadotropin (hCG) 10 IU/ml
Estradiol 1 µg/ml
Fetal bovine serum (FBS) 10 % (v/v)
-mercaptoethanol 50 µM
d) Hóa chất nhuộm trứng
Hyaluronidase 0,1 %
Phosphate buffered saline polyvinyl alcohol (PBS-PVA): dung dịch PBS nhƣ trên đƣợc bổ sung 0,1 % (w/v) polyvinyl alcohol (PVA)
Aceto-orcein 1 % :
Orcein 0,3 g
Acid acetic 13,5 ml
Nƣớc cất 16,3 ml
Acetone
Dung dịch aceto-glycerol:
glycerol: acid acetic: nƣớc cất theo tỷ lệ 1:1:3
3.3.2.2 Hóa chất dùng cho tinh trùng a) Môi trƣờng bảo quản tinh hoàn a) Môi trƣờng bảo quản tinh hoàn
Dung dịch NaCl 0,9 %
b) Môi trƣờng thu tinh trùng
Môi trƣờng Tris-glucose (theo Iguer và Verstegen, 2001):
Tris 3,025 g Glucose 1,25 g Citrate Natri 1,7 g Penicillin 100 mg Streptomycin 100 mg Lòng đỏ trứng 20 ml Nƣớc cất 100 ml pH 6,82
Áp suất thẩm thấu 381 mOsm
c) Môi trƣờng hoạt hóa tinh trùng
Môi trƣờng Sperm-TALP-1 (theo Sirivaiddyapong và et.al., 1999):
CaCl2 2 mM KCl 3,1 mM MgCl2 0,4 mM NaCl 100 mM NaHCO3 25 mM Na3PO4 0,3 mM Natri pyruvate 1 mM Natri lactate 21,6 mM BSA 10 g/l Hepes 10 mM
Gentamycin S 0,25 g/l
pH 7,21
Áp suất thẩm thấu 303 mOsm
3.3.2.3 Hóa chất dùng cho thụ tinh
Môi trƣờng Fert-TALP (theo Kim et.al., 2006)
CaCl2.2H2O 2 mM KCl 3,2 mM MgCl2.6H2O 0,5 mM NaH2PO4.H2O 0,4 mM Lactic acid 11 mM NaCl 114 mM NaHCO3 25 mM Natri pyruvate 0,2 mM BSA 6 mg/ml Gentamycin 50 µg/ml Heparine 2 µg/ml
Môi trƣờng TYH (theo Toyoda, 1971)
NaCl 119,37 mM KCl 4,78 mM CaCl2 1,71 mM KH2PO4 1,19 mM MgSO4 1,19 mM NaHCO3 25,07 mM Natri pyruvate 1 mM Glucose 5,56 mM BSA 4 g/l Penicillin 75 mg/l Streptomycin sulfate 50 mg/l
3.3.3 Dụng cụ - Thiết bị 3.3.3.1 Dụng cụ 3.3.3.1 Dụng cụ Bình giữ nhiệt Bộ ổn nhiệt Dao mổ Kéo các loại Khay Becher 500 ml Găng tay Lọ cồn Kẹp
Đầu tip các loại
Pipette Pasteur vô trùng Micropipette
Màng lọc (0,2 µm) Dây truyền nƣớc biển
Đĩa petri nhựa (35 x 10 mm) Đĩa petri thủy tinh
Lame và lamel Buồng đếm hồng cầu Ống ly tâm
Ống falcon (15 ml và 50 ml) Eppendorf 1,5 ml
Băng keo parafilm Cá từ
3.3.3.2 Thiết bị
Kính hiển vi đảo ngƣợc (Olympus) Kính hiển vi soi nổi (Nikon SMZ800)
Tủ thao tác vô trùng Nồi hấp Tủ sấy Máy chỉnh pH Máy ly tâm 3.4 Bố trí thí nghiệm
3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để nuôi chín trứng
Mục tiêu thí nghiệm: tăng tỷ lệ trứng chín sau khi nuôi để làm nguồn mẫu cho thụ tinh in vitro.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc chia thành 3 nghiệm thức dựa vào các nồng độ β-mercaptoethanol khác nhau đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi trứng. Nghiệm thức 1: không bổ sung β-mercaptoethanol, đƣợc bố trí trên 10 lô với 249