3.3.3.1 Dụng cụ Bình giữ nhiệt Bộ ổn nhiệt Dao mổ Kéo các loại Khay Becher 500 ml Găng tay Lọ cồn Kẹp
Đầu tip các loại
Pipette Pasteur vô trùng Micropipette
Màng lọc (0,2 µm) Dây truyền nƣớc biển
Đĩa petri nhựa (35 x 10 mm) Đĩa petri thủy tinh
Lame và lamel Buồng đếm hồng cầu Ống ly tâm
Ống falcon (15 ml và 50 ml) Eppendorf 1,5 ml
Băng keo parafilm Cá từ
3.3.3.2 Thiết bị
Kính hiển vi đảo ngƣợc (Olympus) Kính hiển vi soi nổi (Nikon SMZ800)
Tủ thao tác vô trùng Nồi hấp Tủ sấy Máy chỉnh pH Máy ly tâm 3.4 Bố trí thí nghiệm
3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để nuôi chín trứng
Mục tiêu thí nghiệm: tăng tỷ lệ trứng chín sau khi nuôi để làm nguồn mẫu cho thụ tinh in vitro.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc chia thành 3 nghiệm thức dựa vào các nồng độ β-mercaptoethanol khác nhau đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi trứng. Nghiệm thức 1: không bổ sung β-mercaptoethanol, đƣợc bố trí trên 10 lô với 249 trứng; nghiệm thức 2: nồng độ β-mercaptoethanol 50 µM, đƣợc bố trí trên 10 lô với 259 trứng; nghiệm thức 3: nồng độ β-mercaptoethanol 100 µM, đƣợc bố trí trên 10 lô với 255 trứng. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố.
Chỉ tiêu thống kê: tỷ lệ trứng chín sau 72 giờ nuôi.
3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng
Mục tiêu thí nghiệm: nhuộm trứng là một khâu rất quan trọng để xác định tỷ lệ các giai đoạn phát triển của trứng sau khi nuôi, đặc biệt là tỷ lệ trứng đạt đến metaphase II để làm cơ sở cho việc tiến hành thụ tinh in vitro. Trong đó, nồng độ orcein là một yếu tố quyết định.
Cách bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc phân thành 2 nghiệm thức dựa vào nồng độ orcein, nghiệm thức 1: nồng độ orcein 0,75 % đƣợc bố trí trên 23 lô với 437 trứng, nghiệm thức 2: nồng độ orcein 1 % đƣợc bố trí trên 50 lô với 975 trứng. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố.
Chỉ tiêu thống kê: tỷ lệ trứng đƣợc quan sát rõ về tình trạng nhân sau 72 giờ nuôi
3.4.3 Thí nghiệm 3: So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trƣờng TYH và Fert-TALP
Mục tiêu thí nghiệm: tìm ra môi trƣờng thụ tinh thích hợp để tạo hợp tử, từ đó làm cơ sở cho quy trình nuôi phôi trong ống nghiệm.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc bố trí thành 2 nghiệm thức dựa vào sự khác nhau của môi trƣờng thụ tinh. Nghiệm thức 1: môi trƣờng thụ tinh là Fert- TALP, đƣợc bố trí trên 15 lô với 252 trứng, nghiệm thức 2: môi trƣờng thụ tinh là TYH, đƣợc bố trí trên 12 lô với 213 trứng. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố.
Chỉ tiêu thống kê: tỷ lệ hình thành tiền nhân sau khi thụ tinh 24 giờ.
3.5 Phƣơng pháp tiến hành
3.5.1 Thu nhận buồng trứng tại lò mổ
Thời điểm lấy buồng trứng tốt nhất là ngay sau khi chó vừa bị đập chết vì chất lƣợng trứng và tỷ lệ trứng phát triển tốt trong IVM cao hơn so với trứng đƣợc lấy ở thời điểm chó đã qua giai đoạn xử lý nhiệt.
Giai đoạn sinh sản: theo Martins và cộng sự (2006) trứng từ nhóm chó cái đang động dục đạt tới metaphase II trong IVM với tỷ lệ cao hơn trứng từ nhóm chó cái không động dục. Do đó chó đƣợc chọn để lấy buồng trứng trong thí nghiệm này là những chó đang động dục, những chó này có biểu hiện là âm hộ sƣng lên và có dịch nhờn tiết ra hai bên.
Độ tuổi: trung bình độ tuổi bắt đầu động dục của chó là 6-8 tháng, do đó chọn những chó từ 6 tháng tuổi trở lên. Phƣơng pháp xác định tuổi là dựa vào hình dạng của răng.
Công thức răng :
- Răng sữa: 2(3/3cửa, 1/1nanh, 3/3 tiền hàm ) = 28
- Răng vĩnh viễn: 2(3/3cửa, 1/1nanh, 4/4 tiền hàm và 2/3hàm) = 42
Hình dáng răng :
- 1½ năm : đỉnh răng cửa dƣới 1 mòn. - 2½ năm: đỉnh răng cửa dƣới 2 mòn.
Bảng 3.1. Thời gian mọc răng của chó
(Nguồn: The Merck Veterinary manual, 2006)
Thao tác thu nhận buồng trứng:
Đặt chó nằm ngửa, xác định vị trí cần mổ (từ rốn kéo dài xuống về phía đuôi khoảng 5 cm), dùng cồn sát trùng xung quanh vị trí đó. Dùng dao mổ một đƣờng nhỏ để lấy buồng trứng, tuy nhiên buồng trứng rất nhỏ rất khó xác định nên ta phải căn cứ vào vị trí thận, buồng trứng nằm ngay phía dƣới thận, cách thận chừng 2 cm.
Răng Thời gian
Răng cửa sữa 1 Răng cửa sữa 2 Răng cửa sữa 3
Răng cửa 1 Răng cửa 2 Răng cửa 3 Răng nanh sữa
Răng nanh Tiền hàm sữa 2 Tiền hàm sữa 3 Tiền hàm sữa 4 Tiền hàm 1 Tiền hàm 2 Tiền hàm 3 Tiền hàm 4 Răng hàm 1 Răng hàm 2 Răng hàm 3 4 – 5 tuần 4 – 5 tuần 5 – 6 tuần 2 – 5 tháng 2 – 5 tháng 4 – 5 tháng 3 – 4 tuần 5 – 6 tháng 4 – 6 tuần 4 – 6 tuần 6 – 8 tuần 4 – 5 tháng 5 – 6 tháng 5 – 6 tháng 4 – 5 tháng 5 – 6 tháng 6 – 7 tháng 6 – 7 tháng
Buồng trứng ngay sau khi cắt ra đƣợc rửa nhanh với dung dịch PBS có bổ sung kháng sinh (penicillin: 50 µg/ ml, gentamycin: 75 µg/ ml). Sau đó trữ buồng trứng trong ống falcon chứa dung dịch PBS và chuyển nhanh về phòng thí nghiệm (không đƣợc quá 2 giờ), trong thời gian vận chuyển tốt nhất nên giữ buồng trứng ổn định ở nhiệt độ khoảng 37oC.
3.5.2 Xử lý buồng trứng
Buồng trứng từ lò mổ mang về phòng thí nghiệm đƣợc sát trùng nhanh bằng cồn, rửa lại với nƣớc cất, dùng kéo đã đƣợc sát trùng cắt bỏ lớp mô mỡ bao quanh buồng trứng, sau đó buồng trứng đƣợc rửa lại với dung dịch PBS và cho vào đĩa petri vô trùng có sẵn PBS rồi đƣa vào tủ thao tác vô trùng.
3.5.3 Tìm và rửa trứng
Buồng trứng đƣợc cắt nhỏ ở mặt ngoài để giải phóng trứng trong môi trƣờng HEPES-TL-PVA.
Nhìn lƣớt qua thật nhanh trên kính hiển vi soi nổi để xác định những trứng tốt dùng cho IVM.
Dùng pipette Pasteur hút và rửa trứng 2-3 lần trong môi trƣờng nuôi trứng cho đến khi không còn mảnh vỡ bao xung quanh trứng.
3.5.4 Phân loại trứng trƣớc khi nuôi
Chất lƣợng trứng ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng phát triển và tỷ lệ chín của trứng. Do đó trứng đƣợc chọn nuôi là những trứng tốt có nội chất đồng nhất, lớp tế bào cumulus dày. Trứng trƣớc khi nuôi đƣợc phân thành 3 loại:
Loại A có nhiều lớp tế bào hạt tụ bao xung quanh Loại B có một lớp tế bào hạt tụ bao xung quanh. Loại C không có hạt tụ bao quanh.
3.5.5 Nuôi trứng
Chuyển 10 phức hợp trứng với tế bào cumulus (cumulus-oocyte complexes- COCs) vào mỗi giọt nuôi (100 µl) với môi trƣờng NCSU 37 đã đƣợc bổ sung các thành phần, mỗi đĩa petri (35×10 mm) 4 giọt đƣợc phủ 3 ml dầu khoáng và đã đƣợc ủ ấm trƣớc 24 giờ. Sau đó đĩa nuôi đƣợc chuyển vào tủ ấm và nuôi trong 72 giờ ở điều kiện 5 % CO2 , 37oC.
3.5.6 Thu nhận và đánh giá trứng sau khi nuôi 3.5.6.1 Thu nhận trứng sau khi nuôi 3.5.6.1 Thu nhận trứng sau khi nuôi
Cho 200 µl hyaluronidase 0,1 % vào mỗi giọt nuôi, để trong 15 phút
Hút nhiều lần bằng pipette Pasteur để làm
bong lớp tế bào cumulus bao quanhtrứng
Chuyển trứng qua PBS-PVA rửa 3 lần
Đánh giá, phân loại trứng
Trứng loại A Trứng loại B Trứng loại C
3.5.6.2 Đánh giá trứng sau khi nuôi
Đánh giá mức độ giãn nở của lớp tế bào cumulus, đây là một tín hiệu kiểu hình giúp ta biết gián tiếp về mức độ trƣởng thành của trứng. Các mức độ phát triển của tế bào cumulus:
Lớp tế bào cumulus không giãn nở
Lớp tế bào cumulus chỉ giãn nở lớp ngoài cùng
Lớp tế bào cumulus giãn nở hơn một nửa số lớp tế bào bao quanh trứng
Lớp tế bào cumulus giãn nở hoàn toàn
Đánh giá sự trƣởng thành của nhân (quan sát thể cực) và sự trƣởng thành của tế bào chất: Trứng xấu Trứng tốt Trứng chín -Là những trứng thoái hóa -Tế bào chất không đồng nhất bị co cụm hoặc phân tán.
-Không xuất hiện thể cực thứ nhất.
-Là những trứng chƣa chín
-Tế bào chất đồng nhất, chiếm hết xoang tế bào. -Không xuất hiện thể cực thứ nhất.
-Là những trứng trƣởng thành
-Tế bào chất đồng nhất, chiếm hết xoang tế bào. -Xuất hiện thể cực thứ nhất.
Trứng xấu Hình 3.6. Phân loại trứng sau khi nuôi
Những trứng có lớp tế bào cumulus giãn nở, có sự trƣởng thành về nhân và tế bào chất là những trứng đƣợc chọn cho thụ tinh in vitro.
3.5.7 Nhuộm trứng
Hình 3.7. Sự giãn nở của tế bào cumulus
Đậy lamel với 4 góc đã đƣợc bôi ít silicone lên lame và ép xuống nhẹ nhàng, để khô khoảng 30 phút
Ngâm lame trong dung dịch ethanol:acid acetic tỷ lệ 3:1 (v/v) trong 48 giờ
Dùng giấy thấm hết dung dịch cũ ra và dùng pipette Pasteur đẩy từ từ acetone vào, để 15 phút
Rút acetone ra và thay thế bằng aceto-orcein, để khoảng 30 phút
Rút hết aceto-orcein và thay bằng dung dịch aceto-glycerol cho tới khi trứng nhạt màu
Cố định bằng keo dán. Quan sát dƣới kính hiển vi
Chuyển trứng đã đƣợc làm sạch tế bào cumulus với một ít PBS-PVA lên lame
Lưu ý: trong quá trình nhuộm không đƣợc để cho trứng bị khô vì khi đó trứng rất dễ bị biến dạng và bẳt màu không đẹp.
3.5.8 Thu nhận tinh hoàn tại lò mổ
Thời điểm lấy mẫu: khi chó vừa mới bị đập chết, chƣa qua giai đoạn xử lý nhiệt. Chọn chó đực lấy mẫu: những chó có tinh hoàn lộ rõ ra ngoài, kích thƣớc lớn. Lấy mẫu: dùng dao mổ cắt dọc giữa bìu để lộ tinh hoàn ra ngoài, ta lấy luôn cả tinh hoàn và phó tinh hoàn.
Trữ mẫu: trong dung dịch NaCl 0,9 % và mang nhanh về phòng thí nghiệm.
3.5.9 Thu tinh trùng và hoạt hóa tinh trùng
3.5.9.1 Quy trình thu nhận và hoạt hóa tinh trùng (phƣơng pháp Swim-up)
Ủ ấm sẵn ống falcon có chứa 1,5 ml Sperm-TALP-1 hoặc TYH trong tủ CO2.
Cắt phần đuôi phó tinh hoàn trong 2 ml Tris-glucose hoặc TYH để giải phóng tinh trùng
Dùng micropipette hút 1 ml dịch tinh trùng cho vào nhẹ nhàng xuống đáy ống falcon đã đƣợc ủ ấm. Phần dịch còn lại đƣợc dùng để đếm hoạt lực và nồng độ.
Mở nắp ống falcon và đặt nghiêng 30o
trong tủ ấm 5 % CO2, 37oC trong 60 phút.
Lấy ống falcon ra, hút 1 ml dịch tinh trùng nằm phía trên cho vào ống khác, trộn đều nhẹ nhàng, đếm hoạt lực, nồng độ và tỷ lệ tinh tinh trùng sống. Nếu các chỉ tiêu đảm bảo thì tiến hành thụ tinh.
Nếu nồng độ chƣa đủ thì ly tâm (600 vòng/5 phút). Thu phần đáy và kiểm tra lại các chỉ tiêu.
3.5.9.2 Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu đánh giá tinh trùng trong thụ tinh in vitro
a) Xác định hoạt lực tinh trùng
Tiến hành: dùng đũa thủy tinh lấy một giọt tinh đặt lên phiến kính sạch khô, đậy lá kính lên mẫu tinh này và xem ở vật kính 10 và 40.
Nhằm phản ánh hoạt động tối ƣu của tinh trùng, đặt tinh trùng ở 37O
C khi kiểm tra hoạt lực. Có 3 loại vận động đƣợc quan sát: vận động tiến thẳng, vận động
vòng quanh và vận động lắc lƣ. Đánh giá hoạt lực của tinh trùng dựa trên tỉ lệ tinh trùng tiến thẳng và cho điểm từ 0 - 1.
b) Xác định nồng độ tinh trùng
Tiến hành: xác định nồng độ tinh trùng bằng buồng đếm hồng cầu với độ pha loãng 200 lần.
Nồng độ tinh trùng: C = n * b * 50.000 Trong đó:
C : Nồng độ tinh trùng trong 1 ml dịch từ đuôi phó tinh hoàn đƣợc pha loãng với 2 ml môi trƣờng tris – glucose hay TYH
n : Số lƣợng tinh trùng đếm đƣợc trong 5 ô lớn b : Hệ số pha loãng
Nồng độ tinh trùng tối ƣu cho thụ tinh in vitro trong môi trƣờng Fert-TALP là 2,5.107
tế bào/ml (theo Kim et.al., 2005) và 107 tế bào/ml trong môi trƣờng TYH (theo Yamada et.al., 1992).
c) Xác định tỷ lệ tinh trùng sống/chết
Tiến hành:
Trộn đều 1 giọt tinh dịch với 2 giọt eosin 1 % và để 30 giây. Cho thêm 3 giọt nigrosin 10 % rồi trộn đều và để tiếp 30 giây.
Đặt 1 giọt mẫu vừa nhuộm xong lên lame và trải thành lớp mỏng Để mẫu khô tự nhiên
Quan sát tinh trùng dƣới kính hiển vi (vật kính 10) Tinh trùng sống: không bắt màu
Tinh trùng chết: bắt màu hồng
Kiểm tra tổng số 100 tinh trùng, suy ra tỷ lệ % tinh trùng sống. Nếu tỷ lệ tinh trùng sống đạt 80 % trở lên thì mẫu tinh trùng đó tốt.
3.5.10 Phƣơng pháp thụ tinh
Những trứng dùng trong thụ tinh là những trứng sau 72 giờ nuôi đƣợc đánh giá tốt (nội chất đồng đều, lớp tế bào cumulus giãn rộng) bằng cách nhìn nhanh trên kính hiển vi, không qua giai đoạn nhuộm.
3.5.10.1 Thụ tinh bằng môi trƣờng Fert-TALP (Kim et.al., 2006)
Chuẩn bị vi giọt môi trƣờng Fert-TALP (44 µl/giọt) trong đĩa petri, phủ dầu khoáng và đƣợc ủ ấm.
Hút trứng đã đƣợc nuôi 72 giờ ra khỏi giọt nuôi, rửa 3 lần trong Sperm-TALP. Chuyển trứng vào vi giọt đã đƣợc ủ ấm, 10 COCs/giọt.
Hút 2 µl tinh trùng đã đƣợc hoạt hóa (nồng độ 2,5.107 tế bào/ml) cho vào mỗi giọt thụ tinh.
Tiếp theo cho 2 µl heparin vào từng giọt thụ tinh.
Cho đĩa thụ tinh vào tủ ấm 5%CO2, 37oC và nuôi trong 24 giờ. Sau 24
giờ Trứng trƣởng thành
Rửa trứng 2-3 lần trong môi trƣờng thụ tinh
Tạo vi giọt: 10 COCs/giọt, ủ ấm
Tinh trùng
Hoạt hóa tinh trùng (phƣơng pháp Swim-up)
Đánh giá các chỉ tiêu IVF: bơm tinh trùng
vào vi giọt
Cho đĩa thụ tinh vào ủ ấm: 5 % CO2, 37oC
Nhuộm trứng để đánh giá sự hình thành tiền nhân
3.5.10.2 Thụ tinh bằng môi trƣờng TYH (Yamada et.al., 1992)
Chuẩn bị vi giọt môi trƣờng TYH (100 µl/giọt) trong đĩa petri, phủ dầu khoáng và ủ ấm.
Hút trứng đã đƣợc nuôi 72 giờ ra khỏi giọt nuôi, rửa 3 lần trong TYH. Chuyển trứng vào vi giọt đã đƣợc ủ ấm, 10 COCs/giọt.
Hút 10 µl tinh trùng đã đƣợc hoạt hóa (nồng độ 107 tế bào/ml) cho vào mỗi giọt thụ tinh.
Cho đĩa thụ tinh vào tủ ấm 5 % CO2, 37oC và nuôi trong 24 giờ.
3.6 Xử lý số liệu
Xử lý thống kê bằng trắc nghiệm ANOVA sau khi chuyển dạng arcsin ở phần mềm Stagraphic 7.0. Kết quả đƣợc trình bày dƣới dạng X ± SE.
Chƣơng 4
KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để nuôi chín trứng
β-mercaptoethanol có vai trò cải thiện tỷ lệ chín trứng và phát triển phôi ở một số loài động vật, vì nó có vai trò gián tiếp trong việc tổng hợp glutathione (GSH) - một hợp chất quan trọng bảo vệ tế bào khỏi các tác nhân oxy hóa.
Thí nghiệm bổ sung 3 nồng độ β-mercaptoethanol khác nhau (0 µM, 50 µM và 100 µM) vào môi trƣờng nuôi trứng.
Bảng 4.1 Tỷ lệ trứng chín với các nồng độ β-mercaptoethanol Nồng độ β-mercaptoethanol ( µM) Số lô Số trứng nuôi Tỷ lệ trứng chín (%) P 0 10 249 1,3 ± 0,54a 0,02 50 10 259 4,88 ± 1,37b 100 10 255 1,65 ± 0,6a 1.3 4.88 1.65 0 1 2 3 4 5 6 0 50 100 nồng độ β-mercaptoethanol ( µM) tỷ lệ tr ứ ng c hí n (% )
Từ kết quả trên cho thấy tỷ lệ trứng chín ở trƣờng hợp đối chứng với trƣờng hợp bổ sung 50 µM và 100 µM có sự khác biệt về mặt thống kê (p<0,05). Khi bổ sung ở nồng độ 50 µM là có sự khác biệt rõ nhất. Trung bình là 1,3% ở mẫu đối
chứng, 4,88% trong trƣờng hợp bổ sung 50 µM và 1,65% trong trƣờng hợp bổ sung
100 µM.
Tỷ lệ trứng chín ở hai nghiệm thức bổ sung β-mercaptoethanol cao hơn nghiệm thức đối chứng, nên β-mercaptoethanol có vai trò cải thiện tỷ lệ trứng chín mà tốt nhất là ở nồng độ 50 µM. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Kim (2004), tác giả đã báo cáo tỷ lệ trứng chín đạt 20% khi bổ sung 50 µM β-