Virus PRRS đƣợc phân lập theo sơ đồ 3.1. Số tế bào trong 1ml: C =
n*d*104 4
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ phân lập và xác định virus PRRS.
(ĐC: đối chứng. US: chủng Châu Mỹ. EU: chủng Châu Âu) Mẫu (huyết thanh, phổi, hạch phổi)
xử lý mẫu
Gây nhiễm lần 1 trên môi trƣờng tế bào MARC-145.
…
ĐC(+)US ĐC(+)EU ĐC(-) Mẫu
Theo dõi và ghi nhận bệnh tích tế bào hàng ngày trong 7 ngày.
Gây nhiễm lần 2 trên môi trƣờng tế bào MARC-145.
…
ĐC(+)US ĐC(+)EU ĐC(-) Mẫu
Thu hoạch dịch tế bào
Theo dõi và ghi nhận bệnh tích tế bào hằng ngày trong 7 ngày
RT-PCR
RT-PCR
Ghi nhận
kết quả gây nhiễm lần một
Có bệnh tích tế bào. Bệnh tích tế bào nghi ngờ
hoặc không có bệnh tích
Thu hoạch dịch tế bào.
Nhận định kết quả.
Ghi nhận
Phƣơng pháp xử lý mẫu để phân lập virus
Mẫu hạch phổi, phổi đƣợc nghiền trong dung dịch đệm phosphat PBS (cứ 1gam bệnh phẩm nghiền trong 5ml PBS). Sau đó, ly tâm huyễn dịch 5000vòng/phút trong 15 phút. Hút phần nƣớc trong cho vào eppendorf vô trùng và bảo quản trong tủ -700C.
Huyết thanh và mẫu sau khi đƣợc xử lý sẽ lọc qua lƣới lọc 0,2µm trƣớc khi đƣa vào môi trƣờng tế bào.
Phƣơng pháp gây nhiễm tế bào lần thứ nhất với các mẫu đã xử lý
Khi tế bào đã phát triển đầy bề mặt lọ nuôi cấy tạo thành tế bào một lớp thì tiến hành gây nhiễm tế bào.
- Lấy lọ tế bào ra, thay môi trƣờng phát triển bằng môi trƣờng duy trì.
- Gây nhiễm tế bào bằng mẫu huyết thanh, phổi, hạch phổi đã đƣợc xử lý với thể tích là 1ml. Lƣu ý khi đƣa mẫu vào môi trƣờng tế bào cần đƣa vào bề mặt khác bề mặt tế bào tăng trƣởng trong lọ nuôi cấy.
- Cho lọ tế bào đã đƣợc gây nhiễm vào tủ ấm 370C có 5%CO2. Sau 24 giờ thay môi trƣờng duy trì. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Theo dõi và ghi nhận bệnh tích tế bào hằng ngày. Sau 7 ngày thu hoạch dịch tế bào nuôi cấy.
Phƣơng pháp thu hoạch dịch tế bào
- Để lọ tế bào sau khi gây nhiễm 7 ngày vào ngăn đá tủ lạnh cho đến khi tế bào và môi trƣờng đông thành đá, sau đó lấy ra đánh nhẹ vào lòng bàn tay để tế bào bong ra hết rồi để ở nhiệt độ phòng để rã đông tế bào và môi trƣờng. Lặp lại động tác trên thêm 2 lần nữa.
- Hút toàn bộ môi trƣờng trong lọ tế bào vào một ống ly tâm. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Hút lấy phần nƣớc bên trên cho vào eppendorf vô trùng và bảo quản ở -700
C.
Phƣơng pháp gây nhiễm lần hai bằng dịch tế bào đã thu hoạch
Các bƣớc thực hiện giống nhƣ gây nhiễm lần thứ nhất nhƣng thay mẫu huyết thanh, phổi và hạch phổi bằng dịch tế bào đã thu hoạch.
Xử lý mẫu
Phƣơng pháp xác định sự hiện diện của virus bằng kỹ thuật RT-PCR
Phản ứng RT- PCR đƣợc thực hiện theo sơ đồ 3.2 với các mẫu thu hoạch đƣợc sau hai lần gây nhiễm.
Sơ đồ 3.2. Sơ đồ thực hiện phản ứng RT-PCR
Để thực hiện phản ứng phiên mã ngƣợc và khuếch đại đoạn cDNA sau phiên mã ngƣợc với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chúng tôi thực hiện kỹ thuật RT-PCR một bƣớc nhằm hạn chế sự lây nhiễm. Mẫu (Dịch tế bào) Ly trích RNA virus Kỹ thuật RT-PCR một bƣớc Điện di sản phẩm RT-PCR Nhuộm gel
Quan sát kết quả điện di
(dƣới tia UV nhờ vào máy chụp ảnh DNA, đƣợc quan sát nhờ phần mềm Quantity one của công ty Biorad)
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trong suốt thời gian tiến hành đề tài, kết quả chúng tôi ghi nhận đƣợc nhƣ sau