2.3.3.1. Loài mắc bệnh
Loài heo, cả heo nhà lẫn heo rừng đƣợc cho là loài mắc bệnh duy nhất. Tuy nhiên, vịt trời bài thải virus qua phân khi gây nhiễm thực nghiệm với virus PRRS bằng nƣớc uống, chứng tỏ vịt trời cũng mẫn cảm với virus PRRS (Ausvetplan, 2004).
2.3.3.2. Phƣơng thức lây lan
- Trực tiếp: do tiếp xúc trực tiếp giữa thú bệnh và thú khỏe từ mũi- mũi, qua giao phối, thú mẹ truyền virus cho thú con qua tử cung. Ở lợn mẹ mang trùng, virus có thể lây nhiễm cho bào thai ở giai đoạn giữa thai kỳ trở đi. Lợn trƣởng thành có thể bài thải virus trong vòng 14 ngày trong khi đó lợn con và lợn choai có thể bài thải virus trong1-2 tháng.
- Gián tiếp: qua chất bài tiết nhƣ dịch mũi, phân hoặc qua những giọt khí dung.
Theo Hoàng Văn Năm (2001), ngoài việc vận chuyển heo bệnh vào đàn cảm nhiễm và lây lan qua không khí thì ít có bằng chứng nói về cách truyền lây khác. Tuy nhiên, ngƣời ta còn thấy việc lây lan trong đàn giống còn theo con đƣờng truyền tinh dịch. Ở những nọc nhiễm bệnh, tinh dịch trong thời kỳ virus huyết có thể gây bệnh cho đàn chƣa có miễn dịch với mức độ biểu hiện tuỳ thuộc vào kích cỡ đàn, mật độ nuôi và tình trạng vệ sinh. Nhƣ vậy, heo nọc là đối tƣợng truyền lây virus quan trọng trong đàn.
2.3.3.3. Đƣờng xâm nhập
Virus xâm nhập qua đƣờng hô hấp, gieo tinh, tiêu hoá (Ausvetplan, 2004), chất chứa mầm bệnh.
Virus có nhiều ở chất tiết dịch mũi, tinh dịch và phân của heo bệnh. Sau cảm nhiễm, heo bệnh có thể chứa virus trong huyết thanh đến 210 ngày, trong tinh dịch 92 ngày, trong dịch mũi 21 ngày và trong dịch hầu họng đến 157 ngày. Trong đó, tinh dịch và dịch mũi là hai nguồn lây nhiễm đáng quan tâm (dẫn liệu Trần Thị Bích Huyền, 2005).
2.3.3.4. Cơ chế sinh bệnh
Sau khi xâm nhập vào cơ thể, virus nhân lên trong đại thực bào ở tiểu phế nang và trong tế bào nội mô của hệ thống lƣới võng nội. Tế bào biểu mô đƣờng hô hấp trên cũng là nơi thích hợp cho sự nhân lên của virus PRRS. Quá trình virus nhân lên và phá hủy đại thực bào gây ra bệnh tích ở thành mạch, làm thủy thũng tế bào nội mô của tĩnh mạch, giảm hàm lƣợng protein huyết tƣơng đến các mô và tạo các cục huyết khối gây nhiều hậu quả bệnh lý khác nhau. Những biểu hiện khác nhau của bệnh tuỳ thuộc vào khả năng nhân lên hay phá hủy tiểu phế nang, tế bào nội mô và tế bào lympho (dẫn liệu Trần Thanh Phong, 1996).
Tác động phá huỷ đại thực bào phế nang, đặc biệt trên heo con, làm giảm khả năng đề kháng của vật chủ chống lại vi khuẩn kế phát hoặc xâm nhập của các virus khác. Hầu hết sự nhiễm kế phát đƣợc quan sát sau ổ dịch PRRS là bệnh đƣờng hô
hấp. Rõ ràng là nếu những tế bào bảo vệ đầu tiên nhƣ PAM bị phá huỷ thì nó sẽ ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng của vật chủ chống lại vi khuẩn và virus gây bệnh (dẫn liệu Hoàng Văn Năm, 2001). Theo Trần Thanh Phong (1996), do gây suy giảm miễn dịch, bệnh PRRS mở đƣờng cho những vi sinh vật cơ hội nhƣ: Pasteurella multosida, Haemophilus parasuis, Streptococcus suis, A. pleuropneumoniae, Chlamydia psittaci, Leptospira interrogans, virus giả dại, virus cúm, Enterovirus, Parvovirus…
Trên nái mang thai, virus ở dạng tự do hay kết hợp với các tế bào bạch cầu, tế bào đơn nhân trong dòng máu để đến cơ quan sinh sản. Cảm nhiễm có thể xảy ra ở bất cứ giai đoạn nào của quá trình mang thai nhƣng biểu hiện lâm sàng phụ thuộc vào lớn vào giai đoạn nhiễm trùng của bào thai và độc lực của chủng virus gây bệnh. Nhiễm trùng ở giai đoạn đầu và giai đoạn giữa của kỳ mang thai không có hay chỉ có tác động nhẹ so với cảm nhiễm ở giai đoạn sau. Cảm nhiễm xảy ra trong thời kỳ phôi thƣờng có mức độ biểu hiện bệnh rất thấp vì tế bào phôi chƣa biệt hoá, không thích hợp cho sự nhân lên của virus. Mặt khác, lúc này trứng thụ tinh chƣa gắn chặt chẽ với nội mạc tử cung nên sự truyền virus từ mẹ sang phôi bị hạn chế. Trong khi ở giai đoạn sau của kỳ có mang, nhau thai và mạch máu nuôi thai rất phát triển, nhau thai trở thành bộ phận trao đổi chất cần thiết, đồng thời là cầu nối truyền virus và kháng thể chống virus từ mẹ sang thai. Virus có thể qua nhau ở dạng tự do hay kết hợp với các tế bào khác của thú mẹ. Nhiễm trùng giai đoạn này tạo ra nhiều vết bong tróc nhỏ trên tế bào biểu mô nhau thai và bệnh tích hoại tử động mạch cuống rốn, từ đó làm cho bào thai bị thiếu dƣỡng chất, thiếu O2, gây sảy thai kỳ cuối, heo con sinh ra yếu ớt, dị tật và tăng tỷ lệ thai chết tƣơi khi sanh (Prieto và cs, 2000; dẫn liệu của Hoàng Văn Năm, 2001). Nhiễm bệnh dai dẳng cũng là một đặc trƣng của Arterivirus, sự tồn tại dai dẳng gây ra nhiễm bệnh âm ỉ, virus hiện diện ở mức độ thấp trong cơ thể thú và giảm dần theo thời gian (Trần Đức Minh). Theo R.Allende và cs (2000) vào ngày 150 sau gây nhiễm thực nghiệm không phân lập đƣợc virus bằng nuôi cấy tế bào và không phát hiện đƣợc RNA của virus bằng phƣơng pháp RT-PCR.
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ cơ chế sinh bệnh của virus PRRS
(Nguồn:Rosssow, 1998) Virus PRRS
Lây lan trực tiếp qua đƣờng tiêu hoá, gieo tinh và hô hấp
Nhân lên trong màng nhày phổi hoặc đại thực bào
Virus tấn công vào hạch lâm ba
Vào máu gây virus huyết
Phân bố đến các hệ thống của cơ thể và tới các tế bào đơn nhân hoặc đại thực bào
Biểu hiện lâm sàng
Nái : Sảy thai
Phối không đậu
Heo sơ sinh
Khó thở, dấu hiệu thần kinh và tỷ lệ chết cao
Heo sau cai sữa
Gia tăng tỷ lệ chết, có biểu hiện hô hấp Heo thịt Sốt, ăn ít Nọc Ảnh hƣởng đến chất lƣợng tinh
2.3.4. Triệu chứng lâm sàng
Triệu chứng bệnh thể hiện rất khác nhau, theo ƣớc tính, cứ 3 đàn đầu tiên tiếp xúc với mầm bệnh thì một đàn không có biểu hiện bệnh, một đàn có biểu hiện ở mức độ vừa và một đàn ở mức độ nặng. Lý do cho việc này vẫn chƣa có lời giải, tuy nhiên với những đàn khoẻ mạnh thì mức độ bệnh cũng giảm nhẹ hơn, và cũng có thể do virus tạo nhiều biến chủng với độc lực khác nhau. Thực tế nhiều đàn có huyết thanh dƣơng tính nhƣng không có biểu hiện lâm sàng (phòng Dịch tễ, Cục Thú y). Theo Trần Đức Minh thì mức độ lâm sàng thay đổi tuỳ chủng virus, sự biến động khả năng gây bệnh của virus, hàm lƣợng virus tăng trong máu và các mô, khả năng của các chủng có độc lực cao để tái sản hữu hiệu hơn trong cơ thể ký chủ. Bệnh tích
Bệnh tích đại thể:
- Da có thể xuất huyết, thâm tím do chảy máu trong mô.
- Phổi tụ huyết, viêm phổi thuỳ trƣớc với những ổ viêm đốm màu xám, có nhiều dịch ở phổi và màng bao tim.
- Có những ổ hoại tử trên nhau thai của nái bệnh.
Bệnh tích vi thể: - Viêm phổi hoại tử.
- Có sự thoái hoá các đại thực bào ở tiểu phế nang.
Hình 2.4. Triệu chứng tai xanh Hình 2.5. Sảy thai do virus PRRS (Nguồn: http://www.porcilis-prrs.com và http://www.thepigsite.com)
2.3.5. Chẩn đoán
Theo Benfiled (1999), khi trong đàn heo có dấu hiệu rối loạn hô hấp trên các hạng heo, sinh sản bất ổn và năng suất đàn giảm hơn bình thƣờng thì có thể nghi ngờ bệnh do virus PRRS.
Mặt khác, theo Taylor (1995) và dẫn liệu của Hoàng Văn Năm (2001) có cơ sở nghi ngờ bệnh khi:
Tỷ lệ chết lúc sinh >20% Tỷ lệ sảy thai >8%
Tỷ lệ heo con chết trƣớc khi cai sữa >26%
Tỷ lệ heo con chết trong tuần đầu tiên vƣợt quá 25%.
Tuy nhiên, để xác định đúng căn bệnh cần thực hiện các phƣơng pháp chẩn đoán phi lâm sàng khác (dẫn liệu của Võ Thị Đan Thanh, 2006).
2.3.5.2. Chẩn đoán phi lâm sàng
2.3.5.2.1. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể
2.3.5.2.1.1. Phản ứng IPMA (Immuno peroxidase Monolayer Assay)
Đây là phản ứng đầu tiên đƣợc sử dụng để phát hiện kháng thể kháng virus PRRS đƣợc gọi là kỹ thuật miễn dịch peroxidase một lớp. Kỹ thuật này có thể thực hiện trên các dòng tế bào PAM, CL2621, MARC-145. Tế bào sau khi nuôi cấy 24 giờ sẽ đƣợc gây nhiễm với PRRSV và đƣợc ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau đó tế bào đƣợc gây nhiễm sẽ đƣợc cố định và tác dụng với huyết thanh mẫu, ủ khoảng 1 giờ ở 370C và đƣợc cho tác dụng tiếp tục với kháng kháng thể heo cộng hợp HRPO (horseradish peroxidase). Nếu mẫu huyết thanh có chứa kháng thể kháng virus thì 30-50% tế bào sẽ có màu đỏ khi cho lớp tế bào tác dụng với dung dịch chromogen trong 30 phút. Không có sự thay đổi màu của tế bào khi kết quả là âm tính. IPMA đƣợc sử dụng nhiều ở châu âu. Trong chẩn đoán phát hiện thú nhiễm sớm, ngƣời ta thƣờng sử dụng IPMA vì xét nghiệm này cho phép xác định thú nhiễm sau 7-15 ngày và có thể phát hiện kháng thể đến 3 tháng sau khi nhiễm PRRSV (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là không thể xác định trực tiếp hàm lƣợng kháng thể bảo vệ.
Giống nhƣ trong kỹ thuật IPMA, kỹ thuật IFA (kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp) cũng sử dụng nuôi cấy tế bào. Quá trình thực hiện IFA cũng giống với IPMA, chỉ khác là kháng kháng thể heo sử dụng không cộng hợp với HRPO mà cộng hợp với chất phát huỳnh quang FITC (fluorescein isothiocynate). Việc đọc kết quả cần phải có kính hiển vi huỳnh quang. sự hiện diện của màu huỳnh quang trong mẫu xét nghiệm chứng tỏ mẫu có kháng thể kháng virus. Phản ứng có độ đặc hiệu cao 99,5% và cho phép phát hiện kháng thể kháng virus đến 3 tháng sau khi nhiễm (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Nhƣợc điểm của IFA và IPMA là không thể làm tự động nên khó thực hiện với quy mô lớn.
2.3.5.2.1.3. Phản ứng SN (Serum Neutralizing)
Đây là phản ứng trung hòa virus, phản ứng này có độ đặc hiệu cao nhất, đƣợc sử dụng để phát hiện và định hiệu giá kháng thể kháng virus. Nhƣợc điểm của phản ứng này là đắc tiền, khó thực hiện và tốn thời gian vì kháng thể trung hoà xuất hiện chậm (1-2 tháng sau khi nhiễm). Tuy nhiên đây là phản ứng rất tốt để xác định miễn dịch bảo hộ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007 và dẫn liệu của Võ Thị Đan Thanh, 2006).
2.3.5.2.1.4. Phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Xét nghiệm ELISA (xét nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn kết enzyme) có độ nhạy và độ đặc hiệu cao và thực hiện đơn giản hơn so với IFA và IPMA, có thể phát hiện kháng thể trong vòng 3 tuần sau khi nhiễm bệnh. Tuy nhiên hạn chế lớn nhất của phƣơng pháp này là dễ cho kết quả dƣơng tính giả. Tỷ số S/P (sample/position)≥0,4 thì kết quả đƣợc ghi nhận là dƣơng tính. Các phản ứng IFA, SN, ELISA đƣợc sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm ở miền Nam nƣớc Mỹ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
2.3.5.2.2. Các phƣơng pháp phát hiện kháng nguyên
Phƣơng pháp FA (florescent antibody staining-kháng thể huỳnh quang) và IHC (immunohistochemistry staining-hoá mô miễn dịch) có thể đƣợc sử dụng để phát hiện kháng nguyên virus trong mẫu mô.
Phƣơng pháp FA có thể thực hiện trực tiếp trên các mẫu đông lạnh. Phƣơng pháp này cho kết quả nhanh và chi phí thấp, tuy nhiên lại có độ nhạy và độ đặc hiệu không cao. để đảm bảo kết quả chẩn đoán, mẫu cần đƣợc lấy và làm lạnh nhanh.
Phƣơng pháp IHC cũng đƣợc thực hiện trên mẫu mô cắt lát, tuy nhiên phƣơng pháp này có thể thực hiện với các mẫu mô đã đƣợc cố định bằng formol. Điều này là khá quan trọng vì rất thuận lợi trong việc bảo quản mẫu bệnh phẩm. IHC có độ nhạy cao hơn so với FA nhƣng mất nhiều thời gian và tốn chi phí hơn (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
2.3.5.2.3. Phát hiện gen của virus PRRS
Kỹ thuật PCR đƣợc phát triển để phát hiện RNA của virus PRRS trong các mẫu bệnh phẩm. Kỹ thuật này không những có độ đặc hiệu và độ nhạy cao mà thời gian cần thiết thực hiện xét nghiệm cũng ngắn hơn so với phƣơng pháp nuôi cấy tế bào vì thế nó đƣợc sử dụng khá rộng rãi trong chẩn đoán phát hiện virus. Nhiều dạng khác nhau của PCR đƣợc sử dụng, hầu hết chúng đƣợc sử dụng để phát hiện các vùng ORFs 7, ORFs 6 hay ORFs 1b của virus. Để gia tăng độ nhạy trong chẩn đoán PRRSV, nhất là để phân biệt 2 dòng virus thì Han-Kook Chung và cs (2002) đã sử dụng phƣơng pháp multiplex reverse transcription-nested PCR (RT-nPCR) .
Fun in wang (1994) đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR trực tiếp để phát hiện sự tồn tại của virus PRRS trong xác heo thƣơng phẩm và trong tinh dịch con đực. Tuy nhiên kết quả chẩn đoán chƣa đủ làm cơ sở để kết luận bệnh mà chỉ cho phép xác định tình trạng nhiễm của đàn và kỹ thuật này đòi hỏi kỹ thuật viên phải có trình độ kỹ thuật cao. Các quy trình thu nhận và trữ mẫu, quy trình chiết tách và tinh sạch RNA phải đƣợc thực hiện một cách nghiêm ngặt. Do đó kết quả của phản ứng PCR giữa các phòng thí nghiệm khác nhau có thể sẽ khác nhau.
2.3.5.2.4. Phân lập virus trên môi trƣờng tế bào
Trong phân lập virus, cũng nhƣ các phƣơng pháp chẩn đoán khác, khâu đầu tiên và quan trọng nhất đó là cách lấy mẫu và bảo quản mẫu. Mẫu xét nghiệm có thể là huyết thanh, dịch tràn ổ bụng, dịch phế nang, dịch mẫu mô (hạch, phổi, lách).
Trong số đó thì dịch phế nang và huyết thanh đƣợc đánh giá là mẫu tốt nhất cho việc phân lập virus khi dịch bùng phát. PRRSV tồn tại trong huyết thanh lâu hơn trong mô, nhƣng đối với thú già thì lại có nhiều PRRSV trong mô hơn trong máu. Đối với các trƣờng hợp sảy thai ở thời kỳ cuối hay sinh sớm thì nên lấy mẫu ở những heo con sinh ra yếu, trƣớc khi cho bú hơn là thai khô, thai chết lƣu. Việc phân lập virus đối với những thú nhiễm bệnh mãn tính thì hạch amiđan, dịch rữa khí quản là những mẫu có khả năng nuôi cấy tốt hơn so với mẫu huyết thanh và phổi. Một điểm quan trọng khác cần chú ý là nhiệt độ bảo quản mẫu trong quá trình vận chuyển và phân lập virus. Các mẫu bệnh phẩm cần phải đƣợc bảo quản ở 40C hay thấp hơn trong quá trình vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm và thời gian giữ mẫu ở nhiệt độ này tốt nhất là không quá 48 giờ. Những mẫu bệnh phẩm lƣu giữ trong một thời gian dài bắt buộc phải đƣợc bảo quản ở -700C, không đƣợc đông và rã đông mẫu nhiều lần.
Việc phân lập virus gặp nhiều khó khăn vì virus chỉ có thể nhân lên trên hai loại tế bào, đó là: đại thực bào phế nang heo (Porcine Alveolar Macrophage-PAM) và tế bào thận khỉ (MARC-145, CL2621). Tuy nhiên theo Yoon và Stevenson (1999) thì không phải tất cả virus PRRS đều phát triển ở cả hai loại tế bào này mà PAM nhạy cảm với virus hơn so với CL2621, đặc biệt khi mẫu đƣợc dùng là huyết thanh. Còn Han-Kook Chung và cs (2002) cho rằng PRRSV chủng Châu Mỹ phát triển tốt hơn trên MARC-145, ngƣợc lại PRRSV chủng Châu Âu lại phát triển nhanh hơn trên PAM.
Chƣơng 3
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
3.1. Thời gian và địa điểm 3.1.1. Thời gian 3.1.1. Thời gian
Đề tài đƣợc thực hiện từ 3/2007 đến 8/2007
3.1.2. Địa điểm
Địa điểm lấy mẫu: một số trại heo tại TP HCM và các vùng lân cận.
Địa điểm xét nghiệm:
- Phòng nuôi cấy tế bào, Bộ Môn Vi Sinh Truyền Nhiễm, Khoa Chăn Nuôi- Thú Y, Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP HCM.
- Trung Tâm Phân Tích Hoá Sinh Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp HCM.
3.2. Đối tƣợng và số lƣợng mẫu 3.2.1. Đối tƣợng 3.2.1. Đối tƣợng
Heo nái rối loạn sinh sản, thai chết sau khi sinh và heo sau cai sữa có biểu hiện lâm sàng nghi ngờ bệnh.
3.2.2. Số lƣợng mẫu
11 mẫu gồm:
- 6mẫu huyết thanh. - 3 mẫu phổi.
- 2 mẫu hạch phổi.
3.3. Nội dung nghiên cứu