Khi tế bào đã mọc đầy bề mặt nuôi cấy, tạo thành tế bào một lớp thì tiến hành cấy chuyển.
Tách tế bào ra khỏi lọ
Rút bỏ môi trƣờng trong lọ nuôi cấy, rửa lớp tế bào bằng 8-10ml PBSA, rồi rút bỏ.
Cho vào 3ml trypsin, để trong tủ ấm 5 phút sau đó cho một tay cầm lọ tế bào đập nhẹ vào lòng tay kia để đảm bảo tách ra thành những tế bào riêng lẻ.
Bất hoạt trypsin bằng 3ml môi trƣờng phát triển, rồi rút cho vào ống ly tâm (loại 15ml). Dùng thêm 7ml môi trƣờng phát triển để rửa lại lọ nuôi cấy rồi hút cho vào ống ly tâm.
Ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó đổ phần nƣớc trên, búng vào đáy lọ ly tâm cho các tế bào rời nhau. Cho vào ống ly tâm 3ml môi trƣờng phát triển, trộn đều bằng pipette rồi lấy ra 0,1ml để đếm tế bào.
Đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer ▫ Cách tiến hành
Trộn 100µl huyễn dịch tế bào và 900µl thuốc nhuộm trypan blue 0,22% (tỷ lệ pha là 1/10).
Đƣa hỗn hợp thuốc nhuộm và tế bào này lên buồng đếm bằng cách chạm đầu hút có chứa hỗn hợp vào chỗ tiếp giáp giữa buồng đếm và lamella.
Chỉ đếm những tế bào còn sống (màu vàng nhạt, có điểm sáng ở giữa), không đếm những tế bào chết (bắt màu xanh). Vùng đếm là 4 ô vuông lớn (ký hiệu L).
Hình 3.1. Buồng đếm Neubauer
▫ Cách tính kết quả
Trong đó:
C: số tế bào trong 1ml. n: số tế bào trong 4 ô vuông. d: nồng độ pha loãng.
Cho lƣợng tế bào cần cấy chuyển vào trong lọ nuôi cấy mới đã có 8-10 ml môi trƣờng phát triển.
Đƣa lọ tế bào vào ủ ấm 370C có bổ sung 5%CO2.
Theo dõi cứ 3 giờ một lần sự phát triển của tế bào đầy bề mặt nuôi cấy lọ 25cm2 với những lƣợng tế bào 7.105 và 106.
Kết quả đƣợc xử lý bằng phần mềm staTGraphics Ver. 7,0.