3.5.2.1. Hồi phục tế bào
Tế bào đƣợc trữ dƣới dạng đông lạnh ở trong nitơ lỏng, khi muốn sử dụng thì phải hồi phục lại tế bào. Các bƣớc hồi phục tế bào:
Lấy lọ đựng tế bào từ bình nitơ lỏng ra, ngâm vào nƣớc ấm 370C, chờ đến khi nƣớc đá tan hết thì lấy ra.
Dùng pipette chuyển lƣợng tế bào bên trong lọ sang ống ly tâm. Cho thêm 10ml môi trƣờng phát triển vào, chầm chậm từng giọt một. Dùng pipette trộn nhẹ để hỗn hợp hòa đều với nhau.
Ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó bỏ phần nƣớc trên, búng đều vào đáy lọ ly tâm để các tế bào tách rời nhau.
Cho 3ml môi trƣờng phát triển vào, dùng pipette trộn đều rồi hút khoảng 0,1ml ra để đếm.
Cho tế bào vào lọ nuôi cấy đã có sẵn 8-10ml môi trƣờng phát triển. Đƣa lọ tế bào vào tủ ấm ở 370C có bổ sung 5% CO2.
Sau 24 giờ thì thay đổi môi trƣờng.
3.5.2.2. Cấy chuyển tế bào
Khi tế bào đã mọc đầy bề mặt nuôi cấy, tạo thành tế bào một lớp thì tiến hành cấy chuyển.
Tách tế bào ra khỏi lọ
Rút bỏ môi trƣờng trong lọ nuôi cấy, rửa lớp tế bào bằng 8-10ml PBSA, rồi rút bỏ.
Cho vào 3ml trypsin, để trong tủ ấm 5 phút sau đó cho một tay cầm lọ tế bào đập nhẹ vào lòng tay kia để đảm bảo tách ra thành những tế bào riêng lẻ.
Bất hoạt trypsin bằng 3ml môi trƣờng phát triển, rồi rút cho vào ống ly tâm (loại 15ml). Dùng thêm 7ml môi trƣờng phát triển để rửa lại lọ nuôi cấy rồi hút cho vào ống ly tâm.
Ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó đổ phần nƣớc trên, búng vào đáy lọ ly tâm cho các tế bào rời nhau. Cho vào ống ly tâm 3ml môi trƣờng phát triển, trộn đều bằng pipette rồi lấy ra 0,1ml để đếm tế bào.
Đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer ▫ Cách tiến hành
Trộn 100µl huyễn dịch tế bào và 900µl thuốc nhuộm trypan blue 0,22% (tỷ lệ pha là 1/10).
Đƣa hỗn hợp thuốc nhuộm và tế bào này lên buồng đếm bằng cách chạm đầu hút có chứa hỗn hợp vào chỗ tiếp giáp giữa buồng đếm và lamella.
Chỉ đếm những tế bào còn sống (màu vàng nhạt, có điểm sáng ở giữa), không đếm những tế bào chết (bắt màu xanh). Vùng đếm là 4 ô vuông lớn (ký hiệu L).
Hình 3.1. Buồng đếm Neubauer
▫ Cách tính kết quả
Trong đó:
C: số tế bào trong 1ml. n: số tế bào trong 4 ô vuông. d: nồng độ pha loãng.
Cho lƣợng tế bào cần cấy chuyển vào trong lọ nuôi cấy mới đã có 8-10 ml môi trƣờng phát triển.
Đƣa lọ tế bào vào ủ ấm 370C có bổ sung 5%CO2.
Theo dõi cứ 3 giờ một lần sự phát triển của tế bào đầy bề mặt nuôi cấy lọ 25cm2 với những lƣợng tế bào 7.105 và 106.
Kết quả đƣợc xử lý bằng phần mềm staTGraphics Ver. 7,0.
3.5.3. Phƣơng pháp phân lập virus
Virus PRRS đƣợc phân lập theo sơ đồ 3.1. Số tế bào trong 1ml: C =
n*d*104 4
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ phân lập và xác định virus PRRS.
(ĐC: đối chứng. US: chủng Châu Mỹ. EU: chủng Châu Âu) Mẫu (huyết thanh, phổi, hạch phổi)
xử lý mẫu
Gây nhiễm lần 1 trên môi trƣờng tế bào MARC-145.
…
ĐC(+)US ĐC(+)EU ĐC(-) Mẫu
Theo dõi và ghi nhận bệnh tích tế bào hàng ngày trong 7 ngày.
Gây nhiễm lần 2 trên môi trƣờng tế bào MARC-145.
…
ĐC(+)US ĐC(+)EU ĐC(-) Mẫu
Thu hoạch dịch tế bào
Theo dõi và ghi nhận bệnh tích tế bào hằng ngày trong 7 ngày
RT-PCR
RT-PCR
Ghi nhận
kết quả gây nhiễm lần một
Có bệnh tích tế bào. Bệnh tích tế bào nghi ngờ
hoặc không có bệnh tích
Thu hoạch dịch tế bào.
Nhận định kết quả.
Ghi nhận
Phƣơng pháp xử lý mẫu để phân lập virus
Mẫu hạch phổi, phổi đƣợc nghiền trong dung dịch đệm phosphat PBS (cứ 1gam bệnh phẩm nghiền trong 5ml PBS). Sau đó, ly tâm huyễn dịch 5000vòng/phút trong 15 phút. Hút phần nƣớc trong cho vào eppendorf vô trùng và bảo quản trong tủ -700C.
Huyết thanh và mẫu sau khi đƣợc xử lý sẽ lọc qua lƣới lọc 0,2µm trƣớc khi đƣa vào môi trƣờng tế bào.
Phƣơng pháp gây nhiễm tế bào lần thứ nhất với các mẫu đã xử lý
Khi tế bào đã phát triển đầy bề mặt lọ nuôi cấy tạo thành tế bào một lớp thì tiến hành gây nhiễm tế bào.
- Lấy lọ tế bào ra, thay môi trƣờng phát triển bằng môi trƣờng duy trì.
- Gây nhiễm tế bào bằng mẫu huyết thanh, phổi, hạch phổi đã đƣợc xử lý với thể tích là 1ml. Lƣu ý khi đƣa mẫu vào môi trƣờng tế bào cần đƣa vào bề mặt khác bề mặt tế bào tăng trƣởng trong lọ nuôi cấy.
- Cho lọ tế bào đã đƣợc gây nhiễm vào tủ ấm 370C có 5%CO2. Sau 24 giờ thay môi trƣờng duy trì.
- Theo dõi và ghi nhận bệnh tích tế bào hằng ngày. Sau 7 ngày thu hoạch dịch tế bào nuôi cấy.
Phƣơng pháp thu hoạch dịch tế bào
- Để lọ tế bào sau khi gây nhiễm 7 ngày vào ngăn đá tủ lạnh cho đến khi tế bào và môi trƣờng đông thành đá, sau đó lấy ra đánh nhẹ vào lòng bàn tay để tế bào bong ra hết rồi để ở nhiệt độ phòng để rã đông tế bào và môi trƣờng. Lặp lại động tác trên thêm 2 lần nữa.
- Hút toàn bộ môi trƣờng trong lọ tế bào vào một ống ly tâm. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Hút lấy phần nƣớc bên trên cho vào eppendorf vô trùng và bảo quản ở -700
C.
Phƣơng pháp gây nhiễm lần hai bằng dịch tế bào đã thu hoạch
Các bƣớc thực hiện giống nhƣ gây nhiễm lần thứ nhất nhƣng thay mẫu huyết thanh, phổi và hạch phổi bằng dịch tế bào đã thu hoạch.
Xử lý mẫu
Phƣơng pháp xác định sự hiện diện của virus bằng kỹ thuật RT-PCR
Phản ứng RT- PCR đƣợc thực hiện theo sơ đồ 3.2 với các mẫu thu hoạch đƣợc sau hai lần gây nhiễm.
Sơ đồ 3.2. Sơ đồ thực hiện phản ứng RT-PCR
Để thực hiện phản ứng phiên mã ngƣợc và khuếch đại đoạn cDNA sau phiên mã ngƣợc với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chúng tôi thực hiện kỹ thuật RT-PCR một bƣớc nhằm hạn chế sự lây nhiễm. Mẫu (Dịch tế bào) Ly trích RNA virus Kỹ thuật RT-PCR một bƣớc Điện di sản phẩm RT-PCR Nhuộm gel
Quan sát kết quả điện di
(dƣới tia UV nhờ vào máy chụp ảnh DNA, đƣợc quan sát nhờ phần mềm Quantity one của công ty Biorad)
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trong suốt thời gian tiến hành đề tài, kết quả chúng tôi ghi nhận đƣợc nhƣ sau
4.1. Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145
Để khảo sát đặc điểm phát triển của tế bào MARC-145 hiện có, chúng tôi ghi nhận thời gian một lần cấy chuyển (thời gian tế bào phát triển đầy bề mặt nuôi cấy tạo thành tế bào một lớp) với hai mức tế bào ban đầu đƣa vào môi trƣờng là 7. 105
và 106, khảo sát đƣợc lặp lại 2 lần.
Thời gian một lần cấy chuyển không những giúp xác định tính ổn định của tế bào mà còn có thể chủ động về thời gian phân lập virus. Trong quá trình thực hiện nuôi cấy tế bào MARC-145 ở bình flash 25 cm2, kết quả đƣợc trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145
Lƣợng tế bào (tế bào/ml)
Thời gian phát triển đầy bề mặt nuôi cấy (giờ)
Lần 1 Lần 2 Trung bình
7.105 72.75 72 72.56
106 46.25 45.75 46
Qua bảng 4.1, chúng tôi nhận thấy, khi thực hiện cấy chuyển tế bào MARC- 145 trên bình 25cm2, với lƣợng tế bào 7.105
thì trung bình sau 72,56 giờ tế bào sẽ phát triển đầy bề mặt nuôi cấy. Khi lƣợng tế bào là 106 thì thời gian tế bào tạo thành một lớp ngắn hơn, trung bình là 46 giờ. Kết quả này tƣơng đối phù hợp với kết quả của Hoàng Thanh Hải (2005) (70,5 giờ và 43,5 giờ) và của Võ Thị Đan Thanh (2006) với lƣợng tế bào 7.105 và 106 thì thời gian một lần cấy chuyển trung bình là 71 giờ và 45.5 giờ. Nhƣ vậy, sự phát triển của dòng tế bào MARC-145 chúng tôi đang sử dụng tƣơng đối ổn định có thể dùng để phân lập virus PRRS.
4.2. Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trƣờng tế bào MARC-145
Với 11 mẫu (gồm 6 mẫu huyết thanh, 3 mẫu phổi và 2 mẫu hạch phổi) đƣợc lấy từ thai chết tƣơi và heo con yếu có biểu hiện lâm sàng nghi ngờ nhiễm virus PRRS, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu và phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC-145. Sau khi gây nhiễm, chúng tôi so sánh biểu hiện bệnh tích trên môi trƣờng tế bào đã đƣợc gây nhiễm với các mẫu đối chứng dƣơng và đối chứng âm bằng việc đánh giá tế bào chết sau khi gây nhiễm. Kết quả gây nhiễm lần một đƣợc ghi nhận ở bảng 4.2.
Chúng tôi nhận thấy: Sau khi gây nhiễm 2 ngày, 1 mẫu hạch phổi trong số 5
mẫu phổi và hạch phổi đã có biểu hiện bệnh tích tế bào. Bệnh tích chủ yếu tế bào co
tròn, chết và bong lên khỏi bề mặt nuôi cấy. Tỷ lệ tế bào chết tăng dần đến ngày thứ
7 là 85%. Kết quả của chúng tôi tƣơng tự nhƣ nhận xét của Võ Thị Đan Thanh
(2006) về kiểu bệnh tích trên môi trƣờng tế bào. Tuy nhiên về thời gian và tỷ lệ tế
bào chết khác nhau, điều này có thể do nhiều yếu tố ảnh hƣởng nhƣ địa điểm, thời
gian và đời của tế bào MARC-145 chúng tôi sử dụng.
Hai mẫu khác (1 mẫu hạch phổi và 1 mẫu phổi) đƣợc chúng tôi xếp vào nhóm mẫu có biểu hện bệnh tích nghi ngờ sau lần gây nhiễm đầu tiên do tỷ lệ tế bào chết thấp (5-20%) và thời gian xuất hiện bệnh tích lâu (sau 5 ngày nuôi cấy). Toàn bộ 6 mẫu huyết thanh đều có kết quả giống đối chứng âm.
Nhƣ vậy, trong tổng số 11 mẫu gây nhiễm lần đầu tiên, có 1 mẫu hạch phổi có biểu hiện bệnh tích tế bào, 1 mẫu phổi và 1 mẫu hạch phổi khác có bệnh tích ở dạng nghi ngờ, các mẫu còn lại đều giống đối chứng âm.
Khi phân lập virus trên môi trƣờng tế bào, virus có thể gây bệnh tích tế bào chậm hoặc không gây bệnh tích tế bào ở lần gây nhiễm đầu tiên, nhƣng ở lần gây nhiễm tiếp theo (passage) có thể xuất hiện bệnh tích (Murphy và cs, dẫn liệu của Võ Thị Đan Thanh, 2006). Do đó, chúng tôi thu hoạch dịch tế bào và gây nhiễm lần 2 trên môi trƣờng tế bào MARC-145.
Bảng 4.2 Kết quả gây nhiễm lần 1 trên môi trƣờng tế bào MARC-145.
Loại mẫu
Tỷ lệ tế bào hƣ họai sau khi gây nhiễm (%) Kết quả CPE 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày
HT1 0 0 0 0 0 0 0 - HT2 0 0 0 0 0 0 0 - HT3 0 0 0 0 0 0 0 - HT4 0 0 0 0 0 0 0 - HT5 0 0 0 0 0 0 0 - HT6 0 0 0 0 0 0 0 - P1 0 0 0 0 0 0 0 P2 0 0 0 0 5 10 20 ± P3 0 0 0 0 0 0 0 - HP1 0 10 30 50 65 80 85 + HP2 0 0 0 0 5 10 15 ±
HT: huyết thanh P: phổi HP: Hạch phổi CPE: Cytopathogenic effect: bệnh tích tế bào
+: có bệnh tích tế bào -: không bệnh tích ±: bệnh tích nghi ngờ
4.3. Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145
10 mẫu dịch tế bào thu hoạch trong lần gây nhiễm đầu đƣợc chúng tôi thực hiện gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 4.3.
Bảng 4.3. Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145
Loại mẫu
Tỷ lệ tế bào hƣ họai sau khi gây nhiễm (%) Kết quả C.P.E 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày DTBHT1 0 0 0 0 0 0 0 - DTBHT2 0 0 0 0 0 0 0 - DTBHT3 0 0 0 0 0 0 0 - DTBHT4 0 0 0 0 0 0 0 - DTBHT5 0 0 0 0 0 0 0 - DTBHT6 0 0 0 0 0 0 0 - DTBP1 0 0 0 0 0 0 0 - DTBP2 0 0 0 8 15 20 25 ± DTBP3 0 0 0 0 0 0 0 - DTBHP2 0 0 0 5 10 15 20 ±
CPE: Cytopathic effect (bệnh tích tế bào)
+: có bệnh tích tế bào HP: hạch phổi ±: bệnh tích tế bào nghi ngờ HT: huyết thanh
: không có bệnh tích tế bào P: phổi DTB: dịch tế bào
Qua bảng 4.3, chúng tôi nhận thấy: các mẫu có kết quả nghi ngờ ở lần gây nhiễm thứ nhất, sau khi gây nhiễm lần hai có biểu hiện bệnh tích tế bào sớm hơn (lúc 4 ngày) nhƣng tỷ lệ tế bào chết không tăng nhiều. Tỷ lệ tế bào chết vào ngày thứ 7 là 20-25 %. Do đó, chúng tôi vẫn xếp 2 mẫu này vào nhóm mẫu có bệnh tích nghi ngờ.
Nhƣ vậy, sau 2 lần gây nhiễm trên môi trƣờng tế bào MARC-145, có 3 mẫu có biểu hiện bệnh tích tế bào, chiếm tỷ lệ 27,27% (3/11) là 2 mẫu hạch phổi và 1 mẫu phổi.
Một số hình ảnh về phân lập virus trên môi trƣờng tế bào MARC-145:
Hình 4.1. Đối chứng âm (độ phóng đại 100 lần)
Hình 4.2. Mẫu không có bệnh tích tế bào (độ phóng đại 100 lần)
Hình 4.3. Đối chứng dƣơng (độ phóng đại 100 lần)
Hình 4.4. Bệnh tích tế bào
vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu HP. (độ phóng đại 100 lần)
Hình 4.5. Bệnh tích tế bào
vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu P2. (độ phóng đại 100 lần)
4.4. Kết quả RT-PCR
Sau hai lần gây nhiễm, chúng tôi tiến hành thu hoạch dịch tế bào và thực
hiện phản ứng RT-PCR để xác định sự hiện diện của virus PRRS trong môi trƣờng
tế bào. Chúng tôi chỉ tiến hành chạy PCR trên những mẫu có biểu hiện bệnh tích tế
bào vì điều kiện thiếu hoá chất. Tuy nhiên do một số hạn chế trong thời gian chúng
tôi đang tiến hành kỹ thuật này nhƣ hoá chất, máy đọc gel bị trục trặc,... nên chúng
tôi gởi mẫu đi xác định bằng kỹ thuật RT-PCR.
Bảng 4.4 Kết quả RT-PCR từ mẫu dịch tế bào sau khi gây nhiễm
CPE: cytopathic effect (bệnh tích tế bào) HT: huyết thanh
+: có bệnh tích tế bào P: phổi
±: bệnh tích tế bào nghi ngờ HP: hạch phổi -: không bệnh tích tế bào DTB: dịch tế bào KTH: không thực hiện
Loại mẫu Gây nhiễm lần một Gây nhiễm lần hai
Kết quả CPE Kết quả RT-PCR Kết quả CPE Kết quả RT-PCR
DTB HT 1 KTH KTH DTB HT 2 KTH KTH DTB HT 3 KTH KTH DTB HT 4 KTH KTH DTB HT 5 KTH KTH DTB HT 6 KTH KTH DTB P 1 KTH KTH DTB P 2 ± KTH ± DTB P 3 KTH KTH DTB HP1 + + KTH DTB HP2 ± KTH ±
Việc gây bệnh tích tế bào và kết quả RT-PCR dƣơng tính dã xác định sự hiện diện của virus trong mẫu xét nghiệm. Nhƣ vậy, bƣớc đầu chúng tôi đã thực hiện thành công việc phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC-145 từ mẫu hạch phổi. Điều này cũng cho thấy môi trƣờng tế bào MARC-145 là môi trƣờng thích hợp cho sự phát triển của virus PRRS và có thể sử dụng cho phân lập. Kết quả của chúng tôi phù hợp với sự nhận định của Jeong-Ki Kim và cs (2005): tế bào MARC-145 là dòng tế bào nhạy cảm với virus PRRS nên thích hợp cho việc phân lập virus này.
Hình 4.6.Kết quả RT-PCR mẫu ly trích từ dịch nuôi cấy tế bào
USA: chủng Châu Mỹ EU: chủng Châu Âu Lad: thang chuẩn Giếng 1: mẫu DTB HP từ kết quả CPE lần một.
Giếng 2: mẫu DTB P2 từ kết quả CPE lần hai. Giếng 3: mẫu DTB HP2 từ kết quả CPE lần hai.
1 2 3 Lad USA EU
Trong tổng số 11 mẫu phân lập, chúng tôi đã ghi nhận đƣợc có 3 mẫu có bệnh tích tế bào khi gây nhiễm trong đó có 2 mẫu cho kết quả nghi ngờ. Các mẫu cho bệnh tích trên tế bào MARC-145 là mẫu phổi và hạch phổi của heo sau cai sữa có biểu hiện bệnh lý hô hấp.
Bằng kỹ thuật RT-PCR xác định đƣợc 1 mẫu dịch tế bào từ hạch phổi có sự hiện diện virus PRRS, chiếm tỷ lệ 50% (1/2 hạch phổi). Kết quả của chúng tôi khác với Hoàng Thanh Hải (2005), tác giả chƣa thành công trong việc phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC-145 từ các loại mẫu đƣợc lấy từ lò mổ nhƣ: huyết thanh, máu, hạch phổi và dich rữa khí quản. Sự khác nhau này theo chúng tôi
