X = x(t)
3.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
− Sử dụng máy đo pH. 3.3.2 Nồng độ chất khơ − Sử dụng khúc xạ kế để bàn, đơn vị đo là oBx. 3.3.3 Hàm lượng đường khử [4] 3.3.3.1 Nguyên tắc
− Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với với thuốc thử 3,5 – dinitrosalicylic acid (thuốc thử DNS). DNS cĩ màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3–amino-5-nitrosalicylic cĩ màu đỏ cam.
NO2 OH COOH NO2 3C6H12O6 + + 4NaOH NH2 OH COONa NO2 3C5H11COONa + 3H 2O
− Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định, được đo bằng máy quang phổ so màu. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử, ta sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. Hợp chất tạo thành cĩ độ hấp thu mạnh nhất trong khoảng bước sĩng 540 – 600 nm.
3.3.3.2 Hĩa chất
• Thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic acid
− Hịa tan 1g DNS (C7H4N2O7) và 1,6g NaOH trong khoảng 60 – 70mL nước cất. Sau đĩ cho 30g Kali Natri Tartrate (C4H4O6KNa.4H2O) vào hỗn hợp trên và khuấy cho tan hồn tồn.
− Chuyển dung dịch trên vào bình định mức 100mL và định mức đến vạch.
− Dung dịch sau khi pha được bảo quản trong chai thủy tinh màu ở điều kiện lạnh (6- 8oC), dùng tốt nhất trong 15 ngày.
• Dung dịch đường chuẩn
− Dung dịch đường chuẩn là dung dịch chứa hỗn hợp glucose và fructose với tỉ lệ 1:1 (w:w), cĩ nồng độ là 2g/L.
3.3.3.3 Cách tiến hành
• Xử lý mẫu
− Vì trong dịch nho cĩ chứa nhiều acid hữu cơ, các chất màu và nhiều tạp chất khác nên ta phải tiến hành xử lý mẫu hợp lý để khơng làm ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.
• Acid hữu cơ: trung hịa acid trong mẫu bằng dung dịch NaOH 0,1N.
• Chất màu và các tạp chất khác: cho dung dịch Ba(OH)2 0,3N và ZnSO4 5% với tỷ lệ 1:1 vào mẫu → Ba(OH)2 và ZnSO4 phản ứng với nhau tạo kết tủa, tách các chất màu và các tạp chất khác và làm trong mẫu.
• Dựng đường chuẩn
− Lần lượt cho 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1mL dung dịch chuẩn 2g/L vào 5 ống nghiệm khác nhau.
− Sau đĩ, lần lượt thêm vào các ống nghiệm 2,8; 2,6; 2,4; 2,2 và 2mL nước cất theo đúng thứ tự ống nghiệm như trên.
− Cho thêm vào mỗi ống nghiệm 1mL dung dịch DNS, lắc đều.
− Dùng một miếng nylon sạch bịt kín miệng ống nghiệm và tiến hành đun cách thủy ở nhiệt độ 100oC trong thời gian 5 phút.
− Làm nguội nhanh dung dịch, cho thêm 10mL nước cất và lắc đều cho đến khi dung dịch khơng cịn phân lớp.
− Đo độ hấp thu A ở bước sĩng λ = 540nm.
− Làm mẫu trắng với 1mL nước cất để hiệu chỉnh máy so màu về 0. − Từ các kết quả đo được, ta tiến hành xây dựng đường chuẩn C = f(A).
• Xác định hàm lượng đường khử trong mẫu thí nghiệm
− Pha lỗng mẫu sao cho nồng độ đường khử trong mẫu ≤ 2g/L.
− Lấy vào ống nghiệm 1mL mẫu, 2mL nước cất và 1mL dung dịch DNS, lắc đều. Sau đĩ tiến hành tương tự như trên.
− Từ đồ thị đường chuẩn ta xác định đường nồng độ đường khử cĩ trong mẫu nghiên cứu.
3.3.4 Hàm lượng nitơ amin tự do [4]
− Định lượng nitơ amin bằng phương pháp so màu với thuốc thử là ninhydrin.
3.3.4.1 Nguyên tắc
− Cơ chế phản ứng: Khi pH lớn hơn 4, các gốc nitơ amin tự do sẽ phản ứng với ninhydrin, tạo phức cĩ màu xanh tím.
O O O R CH NH2 COOH O O OH H NH3 CO2 RCHO + + + + ninhydrin khử ninhydrin O O OH H NH3 O O O O O O O N + + + phức Ruheman (xanh tím) 2H2O 3.3.4.2 Hố chất
− Dung dịch chuẩn glycine: hịa tan 0,1072g glycine và định mức đến 100mL. Bảo quản ở 4oC. Trước khi sử dụng pha lỗng dung dịch này 50 lần được dung dịch A.
− Hịa tan 10g Na2HPO4.12H2O, 6g KH2PO4, 0,5g ninhydrin và 0,3g fructose trong nước và định mức đến 100mL được dung dịch B. Chỉnh pH cuối 6,6 – 6,8. Dung dịch B được bảo quản trong tối ở 4oC, dùng trong 2 tuần.
− Hịa tan 1g KIO3 trong 300mL nước cất và 200mL cồn 96% v/v được dung dịch C. Dung dịch C được bảo quản ở 5oC.
3.3.4.3 Cách tiến hành
− Pha lỗng dịch nho và dịch lên men 50 lần.
− Cho 2mL dung dịch đã pha lỗng và 1mL dung dịch B vào mỗi 3 ống nghiệm. Đun cách thủy (ở 100oC) trong 16 phút, làm nguội về nhiệt độ 20oC trong bể nước 20oC trong thời gian 20 phút.
− Cho tiếp vào ống nghiệm 5mL dung dịch C, lắc đều và đo độ hấp thu ở bước sĩng λ = 570nm trong vịng 30 phút.
− Làm 3 mẫu chuẩn song song với 2mL dung dịch A.
− Làm mẫu trắng với 2 mL dung dịch nước cất để hiệu chỉnh máy so màu về 0.
3.3.4.4 Kết quả
N = AA x2x100
2 1
− Trong đĩ:
• N: số mg nitơ amin cĩ trong 1L dịch nho cần đo, mg/L • A1: độ hấp thu của mẫu thí nghiệm (giá trị trung bình). • A2: độ hấp thu của mẫu chuẩn (giá trị trung bình).
3.3.5 Hàm lượng nitơ ammonium [184]
Xác định nitơ ammonium bằng phương pháp indophenol.
3.3.5.1 Nguyên tắc
Indophenol là hợp chất cĩ màu xanh, được tạo thành bằng phản ứng giữa ammonia, hypochlorite và phenol. Phản ứng này được xúc tác bởi sodium nitroprusside.
3.3.5.2 Hố chất
− Dung dịch phenol: trộn 11mL phenol lỏng (≥ 89%) và định mức thành 100mL bằng ethanol 95%. Dung dịch này chỉ dùng trong 1 tuần.
− Sodium nitroprusside 0,5%w/v: hồ tan 0,5g sodium nitroprusside vào trong 100mL nước. Dung dịch này dùng trong 1 tháng.
− Alkaline citrate: hịa tan 200g trisodium citrate và 10g NaOH trong nước cất → định mức thành 1L.
− Sodium hypochlorite 5%: đây là dung dịch cĩ bán sẵn trên thị trường. Dung dịch này dùng trong 2 tháng.
− Dung dịch oxy hĩa: trộn 100mL dung dịch alkaline citrate với 25mL sodium hypochlorite. Dung dịch này chỉ dùng trong 1 ngày.
− Dung dịch chuẩn N 1g/L: hịa tan 4,7143g (NH4)2HPO4 trong nước cất và định mức thành 1L.
− Dung dịch chuẩn N 10mg/L: hút 10mL dung dịch chuẩn N 1g/L và định mức thành 1L.
− Từ dung dịch chuẩn N 10mg/L pha lỗng thành 5 dung dịch chuẩn: 0,1mg/L; 0,2mg/L; 0,3mg/L; 0,4mg/L và 0,5mg/L.
3.3.5.3 Cách tiến hành
− Cho 25mL mẫu vào erlen 50mL, thêm vào đĩ: • 1mL dung dịch phenol
• 1mL dung dịch sodium nitroprusside • 2,5mL dung dịch oxy hĩa
− Bao erlen bằng màng plastic, để ở nhiệt độ phịng (22 - 27oC) ở nơi cĩ ánh sáng nhẹ trong vịng ít nhất là 1h. Dung dịch bền màu trong vịng 24h.
− Dựng đường chuẩn: tiến hành tương tự như trên với các dung dịch chuẩn 0,1mg/L; 0,2mg/L; 0,3mg/L; 0,4mg/L và 0,5mg/L.
− Cũng tiến hành tương tự với mẫu nước cất để hiệu chỉnh máy về 0. − Đo màu ở bước sĩng 640nm.
3.3.6 Hàm lượng tannin [4]
− Xác định hàm lượng tannin bằng phương pháp so màu sử dụng thuốc thử Folin – Denis.
3.3.6.1 Nguyên tắc
− Tannin bị oxy hĩa bởi acid phosphomolybdic tạo thành hợp chất cĩ màu xanh.
3.3.6.2 Hĩa chất
− Thuốc thử Folin – Denis: cho 100g Na2WO4.2H2O, 20g acid phosphomolybdic và 50mL H3PO4 vào 750mL nước, cho chảy ngược dịng trong 2h, làm nguội, và pha lỗng đến 1L.
− Dung dịch Natri carbonate bão hịa: cho 35g Na2CO3 khan vào 100mL nước, hịa tan ở 70-80oC, sau đĩ để nguội qua đêm. Dung dịch quá bão hịa chứa các mầm tinh thể Na2CO3.10H2O. Sau khi kết tinh, lọc tinh thể qua len thủy tinh.
− Dung dịch chuẩn acid tannic: 0,1g/L. Hịa tan 0,1g acid tannic trong 1L. Chuẩn bị dung dịch mới cho mỗi lần xác định.
3.3.6.3 Cách tiến hành
• Xây dựng đường chuẩn
− Sử dụng pipet lấy từ 0-10mL dung dịch chuẩn acid tannic vào bình định mức 100mL chứa 75mL H2O.
− Thêm 5mL thuốc thử Folin – Denis và 10mL dung dịch Na2CO3, sau đĩ định mức tới 100mL bằng nước cất.
− Trộn đều hỗn hợp trong 30 phút
− Xác định độ hấp thu A ở bước sĩng 760nm.
− Dựng đường chuẩn độ hấp thu A theo mg acid tannic/100mL.
• Đo mẫu
− Dùng 1mL mẫu, xác định độ hấp thụ A tương tự như trên.
− Từ đồ thị đường chuẩn ta xác định đường nồng độ tannin cĩ trong mẫu nghiên cứu.
3.3.7 Hàm lượng sulfur dioxide [171]
− Xác định hàm lượng sulfur dioxide bằng phương pháp Ripper.
3.3.7.1 Nguyên tắc
− Sulfur dioxide cĩ trong dung dịch mẫu sẽ bị oxy hĩa bởi iodine. Lượng iodine dư tác dụng với tinh bột làm cho dung dịch cĩ màu xanh thẫm.
3.3.7.2 Hĩa chất
− Dung dịch NaOH 4M (160g/L). − Acid sulfuric 10% (v/v).
− Dung dịch tinh bột, 5g/L: Trộn 5g tinh bột với khoảng 500mL nước. Đun sơi khuấy trộn liên tục và giữ trong 10 phút. Thêm 200g NaCl. Làm nguội và tạo thành 1 lít. − Dung dịch iodine 0,025M.
3.3.7.3 Xác định sulfur dioxide tự do
− Cho vào bình erlen: • 50mL rượu vang. • 5mL dung dịch tinh bột.
• 30mg EDTA.
• 3mL H2SO4.
− Chuẩn độ ngay lập tức với iod 0,025M cho tới khi màu xanh xuất hiện rõ trong 10 đến 15 giây. Ghi n là thể tích iodine sử dụng.
3.3.7.4 Sulfur dioxide dạng liên kết
− Thêm 8 mL dung dịch NaOH, lắc một lần và để yên 5 phút. Thêm 10mL acid sulfuric trong khi khuấy trộn mạnh. Chuẩn độ ngay lập tức với dung dịch iodine 0,025M, ghi n’ là thể tích sử dụng.
− Thêm 20mL NaOH, khuấy trộn đều rồi để yên 5 phút. Pha lỗng với 200mL nước đá lạnh. Thêm 30mL acid sulfuric trong khi khuấy trộn mạnh. Chuẩn độ sulfur dioxide tự do ngay lập tức với iodine 0,025M, và ghi n” là thể tích sử dụng.
3.3.7.5 Kết quả
− Hàm lượng mg sulfur dioxide tự do trong một lít rượu vang: 32 x n
− Hàm lượng mg sulfur dioxide tổng trên một lít rượu vang: 32 (n + n’ + n”)
3.3.8 Hàm lượng ethanol [4]
3.3.8.1 Tiến hành chưng cất
− Cho 20mL mẫu vào bình cất 250mL, ghi lại nhiệt độ. − Thêm vào đĩ 20mL nước cất.
− Bình hứng được đặt trong chậu thủy tinh chứa hỗn hợp nước và đá để làm lạnh.
− Đun nhẹ bình cất (để tránh bọt khơng trào sang bầu bảo hiểm). Tăng nhiệt độ bình cất khi bắt đầu sơi đều.
3.3.8.2 Xác định tỷ trọng của dịch cất
• Chuẩn bị bình tỷ trọng
− Rửa sạch bình tỷ trọng, tráng 3 lần bằng nước cất, 2 lần bằng etanol 96%, hay 2 lần bằng ete etylic hoặc aceton.
− Làm khơ ngồi khơng khí hoặc sấy nhẹ ở 50oC trong 30 phút. Sau đĩ cân để biết khối lượng bình.
• Xác định khối lượng bình và nước cất
− Từ từ cho nước cất vào bình tỷ trọng. Rĩt nhẹ theo thành bình để tránh tạo thành bọt khí. Rĩt đầy đến miệng bình.
− Đậy nút bình tỷ trọng và ngâm trong bể điều nhiệt sao cho mực nước của bể trên vạch mức của bình tỷ trọng.
− Sau 30 phút, mở nút và dùng pipette hút bớt nước cất cho đến khi đáy của mặt khum tiếp xúc với vạch mức.
− Dùng giấy lọc lau khơ bên trong cổ của bình tỷ trọng, nút và ngâm trong nước tại nhiệt độ phịng trong vịng 15 phút.
− Đưa bình tỷ trọng ra khỏi nước.
− Rửa bình tỷ trọng bằng bơng thấm nước etanol 96% cho hết nước bám ngồi bình. Dùng bơng hoặc khăn sạch lau khơ bình. Khi lau chỉ cầm ở cổ bình để tránh khơng gây ra sự thay đổi nhiệt độ của dung dịch trong bình. Tránh khơng để sợi bơng bám lại ở ngồi thành bình.
− Để yên trong vịng 15 phút và cân.
• Xác định khối lượng bình và rượu
− Đổ hết nước ra khỏi bình tỷ trọng, rửa bằng acetone và làm khơ trong khơng khí. − Cho mẫu vào bình tỷ trọng và tiến hành tương tự như đối với nước.
− Sau khi cân biết khối lượng rượu và bình.
3.3.8.3 Tính kết quả
− Tỷ trọng tương đối của rượu (d) tính theo cơng thức:
m m m m d 2 1 − − = − Trong đĩ • m – khối lượng bình tỷ trọng (g) • m1 – khối lượng bình và rượu (g) • m2 – khối lượng bình và nước (g)
− Biết tỷ trọng tương đối (d) tra bảng sẽ tìm được hàm lượng rượu tính theo phần trăm thể tích tại nhiệt độ khảo sát.
3.3.9 Hàm lượng acid tổng [4]
3.3.9.1 Cách tiến hành
− Khử CO2: cho khoảng 25mL mẫu vào 1 erlen nhỏ, gia nhiệt đến bắt đầu sơi và giữ trong 30s, lắc đều và làm lạnh.
− Thêm 1mL phenolphtalein vào 200mL nước sơi nĩng trong erlen 500mL. Trung hịa đến khi cĩ màu hồng nhạt.
− Thêm 10mL mẫu đã khử khí và chuẩn độ bằng NaOH 0,1N.
3.3.9.2 Kết quả
Hàm lượng acid tổng (g acid tartaric/ 100mL rượu vang) = mL NaOH × N × 0,075 × 100/10
3.3.10 Hàm lượng acid dễ bay hơi [171]
3.3.10.1 Cách tiến hành
− Lấy chính xác 20mL mẫu cho vào bình định mức, rồi rĩt vào bình cầu của bộ cất. Dùng khoảng 20mL nước cất tráng sạch bình định mức 2 – 3 lần để chuyển tồn bộ rượu vào bình cầu. Lắp hệ thống chưng cất, hứng dịch cất vào bình định mức trên. − Sau khi chưng cất được 2/3 dung tích bình mức và nhiệt độ hơi cất đạt 100oC thì
ngừng cất. Thêm nước cất gần vạch mức, để ở 20oC trong 30 phút. Sau đĩ thêm nước cất đến vạch mức, lắc đều.
− Lấy 10mL dịch cất cho vào erlen 100mL, thêm 3 giọt phenolphtalein và chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho tới khi cĩ màu hồng bền. Thêm 1mL tinh bột, 5mL acid sulfuric và chuẩn độ với I2 0,02N cho đến khi cĩ màu xanh nhạt.
3.3.10.2 Tính kết quả
Acid dễ bay hơi (g acid acetic /100mL rượu vang) = 0,6 × [(mL NaOH × N NaOH) – (mL I2× N I2)]
3.3.11 Mật độ tế bào [3]
− Đối với nấm men trong dịch lên men: pha lỗng mẫu rồi sau đĩ đếm trên buồng đếm Thoma.
− Đối với nấm men cố định: rã hạt bằng dung dịch EDTA 5%, sau đĩ pha lỗng mẫu đến nồng độ cần thiết rồi đếm trên buồng đếm Thoma.
KẾT QUẢ và BÀN LUẬN
3.4 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG ĐẾN ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU VANG SỬ DỤNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE
Như chúng ta đã biết, đường cĩ ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men, tác động đến sự sinh trưởng cũng như khả năng sinh tổng hợp cồn của nấm men. Khi hàm lượng đường càng cao thì nấm men càng bị ức chế.
Trong phần nghiên cứu này, chúng tơi khảo sát động học quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate với hàm lượng đường ban đầu là 200, 240, 280, 320 và 360g/L. Chúng tơi bổ sung thêm đường để đạt được các giá trị như trên.
3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học
quá trình sinh trưởng của nấm men
Kết quả khảo sát động học quá trình sinh trưởng của nấm men được chúng tơi trình bày trong hình 4.1, hình 4.2 và bảng 4.1. Kết quả cho thấy khi hàm lượng đường ban đầu tăng từ 200 đến 240g/L thì mật độ tế bào nấm men trong dịch lên men tăng và tốc độ sinh trưởng riêng cũng tăng:
− Mật độ tế bào nấm men cố định cực đại ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần lượt là 155,13.106 tế bào/mL và 222,5.106 tế bào/mL. Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của nấm men cố định ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần lượt là 0,248 và 0,344 h-1.
− Mật độ tế bào nấm men tự do cực đại ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần lượt là 164,06.106 tế bào/mL và 240,63.106 tế bào/mL. Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của nấm men tự do ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần lượt là 0,458 và 0,764 h-1.
Nhưng nếu hàm lượng đường ban đầu tăng cao hơn nữa (240 – 360g/L) thì mật độ tế bào giảm và tốc độ sinh trưởng riêng cũng giảm. Như vậy, khi mơi trường lên men chứa quá nhiều đường, khả năng sinh trưởng của nấm men sẽ bị ức chế. Nguyên nhân là do ảnh