men cố định sấy thăng hoa (FGB) trong cơng nghiệp và nhận thấy rằng tuy ở chu kỳ 1, thời gian lên men và năng suất lên men khơng cĩ sự khác biệt so với nấm men tự do (ffdc) nhưng ở chu kỳ 2, nấm men cố định cho năng suất lên men cao hơn hẳn và tốc độ lên men tăng lên đáng kể (Hình 2 .24) [93].
− Bardi và cộng sự (1997) đã lần lượt cố định nấm men trên 2 loại chất mang là DCM và gluten để sử dụng cho quá trình lên men tĩnh nhiều chu kỳ tại các nhiệt độ khác nhau. Kết quả cho thấy nấm men cố định trên DCM cĩ thể sử dụng trong 43 chu kỳ, trong khi đĩ, nấm men cố định trên gluten cĩ thể sử dụng trong 29 chu kỳ. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng khi sử dụng nấm men cố định để tiến hành lên men thì hàm lượng ethyl acetate tạo thành cao gấp 2 – 4 lần so với nấm men tự do, cịn khi sử dụng nấm men cố định trên DCM để lên men ở nhiệt độ thấp thì hàm lượng amyl alcohol thấp hơn nhiều so với nấm men tự do, nhờ vậy mà giảm được độc tính cho sản phẩm rượu vang. Như vậy, sử dụng nấm men cố định sẽ cải thiện hương vị tốt hơn so với nấm men tự do [20].
Hình 2.24: Động học của quá trình lên men rượu vang ở những nhiệt độ khác nhau sử dụng nấm men cố định trên gluten. Dịch nho cĩ nồng độ chất khơ ban đầu là 204g/L, sử dụng nấm men cố định trên gluten sấy thăng hoa (FGB 1,2), nấm men tự do sấy thăng hoa (ffdc) (các chữ số 1 và 2 là lên men lặp lại lần thứ nhất và lần thứ 2)[93]
− Kourkoutas và cộng sự (2003) đã sử dụng nấm men cố định trên miếng mộc qua để lên men rượu vang theo phương pháp lên men tĩnh nhiều chu kỳ. Và kết quả cho thấy rằng quá trình lên men vẫn cĩ thể tiếp tục trong khoảng 8 tháng mà khơng làm mất đi đáng kể hoạt tính của nấm men. Khi thực hiện lên men ở nhiệt độ rất thấp (< 10oC) thì quá trình lên men rượu vang hồn thành chỉ trong vịng 4 ngày, ngắn hơn rất nhiều so với phương pháp lên men truyền thống. Cịn nếu lên men ở 0oC thì thời gian cần thiết khoảng là 50 ngày. Năng suất sinh tổng hợp ethanol thì cao hơn ít nhất là 4 hoặc 5 lần so với quá trình lên men truyền thống. Bên cạnh đĩ, hương vị của sản phẩm cũng được cải thiện nhiều, đặc biệt là ở nhiệt độ thấp [27]. Như vậy, quả mộc qua đã chứng tỏ là chất mang thích hợp cho quá trình sản xuất rượu vang, đặc biệt là ở nhiệt độ thấp. Kết quả nghiên cứu của Kourkoutas và cộng sự (2001) khi cố định trên miếng táo cũng cho kết quả tương tự, với thời gian sử dụng khoảng 7 tháng mà khơng làm mất đi hoạt tính [110].
− Tsakiris và cộng sự (2004) đã tiến hành lên men rượu vang trắng sử dụng nấm men cố định trên nho khơ theo phương pháp lên men tĩnh nhiều chu kỳ và kết quả cho thấy rượu vang tạo thành cĩ hàm lượng acid dễ bay hơi, methanol và acetaldehyde thấp, và nấm men cố định cĩ độ bền sinh học trong khoảng 4 tháng [196]. Một nghiên cứu khác của Tsakiris và cộng sự (2004) cũng cho thấy hệ thống lên men sử dụng nấm men cố định trên nho khơ cĩ độ bền vận hành rất cao, cĩ thể tiến hành quá trình lên men tĩnh nhiều chu kỳ trong khoảng 1 năm mới phải thay nấm men cố định [197].
Ngồi ra, nấm men cố định cịn cĩ thể bảo quản trong một thời dài để sử dụng cho các chu kỳ lên men sau mà vẫn duy trì được hoạt tính lên men tốt. Kourkoutas và cộng sự (2003) đã khảo sát khả năng bảo quản và tái sử dụng của nấm men cố định trên miếng táo,
kissiris và γ-alumina cho quá trình lên men rượu vang tại nhiệt độ thường theo phương pháp lên men tĩnh nhiều chu kỳ. Những kết quả đã cho thấy rằng nấm men cố định cĩ thể hoạt hĩa lại và lên men sau một khoảng thời gian bảo quản tăng đáng kể so với nấm men tự do. Nấm men cố định trên táo và kissiris cĩ thời gian sống sĩt lâu hơn (lần lượt là 40 và 50 ngày) so với nấm men cố định trên γ-alumina và nấm men tự do. Nếu sử dụng mơi trường tổng hợp để bảo quản thì thời gian bảo quản cĩ thể lên đến 6 tháng, nhờ đĩ cĩ thể thực hiện hiệu quả việc bảo quản mà khơng cần làm lạnh hoặc sấy thăng hoa. Các kết quả cũng cho thấy rằng khơng cĩ ảnh hưởng bất lợi đến thành phần các hợp chất hương tạo thành trong suốt quá trình bảo quản [105, 108].
2.4.2.2 Lên men liên tục
Với mục tiêu khơng ngừng cải tiến nhằm mục đích giảm thiểu chi phí một cách tối đa cho sản xuất, tăng năng suất và chất lượng sản phẩm, phương pháp lên men liên tục đã được nghiên cứu rất rộng rãi trong thời gian qua trong lĩnh vực sản xuất đồ uống cĩ cồn. Trong sản xuất rượu vang, phương pháp này cũng được nghiên cứu rộng rãi, đặc biệt là trong những năm gần đây. Nấm men sử dụng trong phương pháp lên men liên tục là nấm men cố định [13, 14, 94, 107, 127]:
− Bakoyianis và cộng sự (1997) đã tiến hành lên men liên tục rượu vang tại nhiệt độ thấp và nhiệt độ phịng sử dụng lần lượt 3 chất mang là kissiris, γ-alumina và calcium alginate. Kết quả cho thấy rằng, mặc dù cùng sử dụng nấm men cố định nhưng năng suất sinh tổng hợp cồn khi lên men theo phương pháp liên tục cao hơn so với phương pháp lên men tĩnh (bảng 2.11) [14].
Bảng 2.11: Năng suất sinh cồn trong quá trình lên men dịch nho bởi nấm men cố định trên kissiris,
γ-alumina và alginate tại 7, 13 và 27oC[14] Nhiệt độ
(oC) Kissiris Lên men tĩnhγ-alumina Alginate Kissiris Lên men liên tụcγ-alumina Alginate 27 13 7 17,3 5,8 1,5 48,6 13,7 4,5 60,3 15,8 5,6 73,4 22,8 16,7 68,5 19,9 13,8 80,6 30,0 23,2
− Kourkoutas và cộng sự (2002) đã thực hiện quá trình lên men rượu vang liên tục sử dụng chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae ưa lạnh cố định trên miếng táo. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng năng suất lên men theo phương pháp này cao hơn nhiều so với phương pháp lên men tĩnh truyền thống. Năng suất lên men cồn ở 5oC thì bằng với năng suất lên men cồn ở 22 – 25oC theo phương pháp truyền thống. Bình lên men cĩ thể vận hành liên tục trong vịng 95 ngày mà khơng làm giảm năng suất tạo cồn. Đồng thời, hàm lượng rượu bậc cao và acetaldehyde trong rượu vang này thì thấp hơn so với rượu vang lên men theo phương pháp lên men tĩnh truyền thống (bảng 2.12). Điều đĩ chứng tỏ rằng chất lượng rượu vang đã được cải thiện [112]. Một nghiên cứu khác của Kourkoutas và cộng sự (2005) khi sử dụng chất mang là miếng táo, mộc qua và lê cũng cho kết quả tương tự [107].
Bảng 2.12: Các hợp chất dễ bay hơi tạo thành trong suốt quá trình lên men liên tục rượu vang sử dụng nấm men cố định trên miếng táo và quá trình lên men tĩnh sử dụng nấm men tự do. Quá trình lên men được thực hiện ở 30oC [112]
Rượu vang Acetaldehyde (ppm) Ethyl acetate (ppm) Propanol – 1 (ppm) Isobutyl alcohol (ppm) Amyl alcohols (ppm) Methanol (ppm) Lên men liên tục
Lên men tĩnh 27 64 59 31 22 10 19 54 123 169 39 Khơng cĩ
− Ogbonna và cộng sự (1989) đã tiến hành quá trình lên men rượu vang theo phương pháp liên tục trong thiết bị phản ứng sinh học nhiều cấp (multistage bioreactor) sử dụng các đĩa sinh học (bioplate) làm tác nhân lên men. Các đĩa sinh học này chính là nấm men cố định trên các đĩa thủy tinh đã được gia cơng tạo mặt lưới. Kết quả nghiên cứu cho thấy quá trình lên men liên tục sử dụng nấm men cố định trên đĩa thủy tinh khơng những cĩ tính ổn định cao, bền trong thời gian dài sử dụng mà cịn cĩ khả năng tạo sản phẩm cĩ chất lượng khơng thua kém sản phẩm tạo ra theo phương pháp lên men truyền thống [152].
2.4.3 Dùng kỹ thuật cố định trong sản xuất một số loại rượu
vang
2.4.3.1 Lên men rượu vang phổ thơng ngọt
Như đã biết, rượu vang khai vị ngọt (sweet dessert wine) là rượu vang cĩ độ bền vi sinh cao vì hàm lượng ethanol xấp xỉ khoảng 17% hoặc cao hơn. Tuy nhiên, rượu vang phổ thơng ngọt (sweet table wine) thì lại khơng đạt được độ bền sinh học vì hàm lượng đường cao và hàm lượng ethanol thấp (nhỏ hơn 15%). Do đĩ, rượu vang phổ thơng ngọt thường rất dễ bị lên men lại trong suốt quá trình bảo quản nếu như khơng được tiệt trùng. Để tiệt trùng loại rượu vang này, người ta thường bổ sung vào rượu vang acid sorbic, SO2 hoặc là tiến hành gia nhiệt rượu vang. Tuy nhiên, bổ sung acid sorbic SO2 sẽ làm cho rượu vang cĩ mùi như mùi bơ. Cịn sử dụng nhiều SO2 sẽ làm cho rượu vang cĩ mùi hăng, mùi H2S hoặc mùi mercaptan [213].
Dừng quá trình lên men trước khi đường trong dịch lên men được sử dụng hết (quá trình lên men khơng hồn thành) là một phương pháp được sử dụng rộng rãi trong sản xuất rượu vang phổ thơng ngọt. Các nhà sản xuất rượu vang cho rằng phương pháp này sẽ tạo ra rượu vang ngọt tự nhiên và cĩ chất lượng cao hơn so với rượu vang được tạo ta bằng phương pháp làm ngọt rượu vang khơ (bằng cách thêm dịch nho hoặc dịch nho đã được lên men một phần vào rượu vang khơ). Phương pháp hữu hiệu để tạo ra rượu vang phổ thơng ngọt với hàm lượng đường mong muốn bằng cách dừng quá trình lên men gồm nhiều bước:
− Làm lạnh để giảm tốc độ lên men.
− Tách dịch lên men ra khỏi nấm men (bằng cách xử lý với bentonite rồi lọc). − Thêm SO2 sau khi lọc xong.
Cĩ thể dừng lên men chỉ bằng quá trình lọc nhưng điều này rất khĩ khăn bởi vì các tế bào nấm men sẽ nhanh chĩng làm nghẽn lớp vật liệu lọc. Vì quá trình lên men khơng dừng ngay lập tức sau khi làm lạnh, tách hoặc sulphite hĩa, cho nên phương pháp trên khĩ mà đạt được hàm lượng rượu như mong muốn [213].
Cách tốt nhất là sử dụng nấm men cố định, nhờ đĩ cĩ thể bắt đầu hoặc kết thúc quá trình lên men bằng cách thêm các hạt nấm men cố định trong gel alginate vào bình lên men hoặc loại các hạt nấm men ra khỏi bình tại thời điểm mong muốn, và tốc độ lên men cĩ thể kiểm sốt bằng cách thay đổi lượng tế bào nấm men cố định thêm vào. Vì rượu vang lên men bởi nấm men cố định rất trong suốt và lượng tế bào tự do trong dịch lên men chỉ khoảng 102 - 105 tế bào/mL, cho nên các tế bào nấm men cĩ thể tách ra bằng phương pháp lọc mà khơng gặp bất cứ vấn đề gì, tương tự như trong trường hợp của rượu vang khơ [213].
2.4.3.2 Lên men rượu vang cĩ gas theo phương pháp Champenoise
Điểm đặc trưng của phương pháp này là quá trình lên men được tiến hành trong chai và sau khi hồn thành quá trình lên men, các tế bào nấm men sẽ được tách ra khỏi chai. Thơng thường, quá trình này được tiến hành bằng phương pháp cơ học bằng cách xoay và chúi đầu chai xuống từ từ cho đến khi tất cả các tế bào nấm men tập trung ở cổ chai. Cuối cùng, tiến hành đơng đá cổ chai, rồi mở nắp chai, khi đĩ phần đơng đá ở cổ chai sẽ bị tách ra khỏi chai nhờ áp lực khí ở bên trong chai [83, 193].
Trong suốt giai đoạn này, quá trình tự phân của nấm men cũng cĩ thể diễn ra, tạo ra một lượng lớn các chất làm giảm hương và vị của rượu vang. Bên cạnh đĩ, quá trình lắng cặn nấm men phải tốn mất nhiều tuần, cùng với một lượng nhân cơng đáng kể và phải cĩ hầm chứa đủ lớn. Mặc dù đã cĩ những palette xoay tự động thay thế cho cơng nhân nhưng quá trình tách nấm men này địi hỏi phải xử lý rất chính xác và cần cĩ một dây chuyền lạnh đơng, vì thế đã làm tăng thêm chi phí đáng kể cho các nhà sản xuất. Bên cạnh đĩ, nhiều nhà sản xuất rượu vang cũng nhân thấy rằng, hương vị của rượu vang bị giảm đi khi xử lý bằng palette xoay tự động so với việc xử lý bằng tay. Vì thế, đã cĩ nhiều nghiên cứu để thay thế cho phương pháp này: sử dụng các chất phụ gia hố học, sử dụng các chủng nấm men cĩ khả năng kết bơng cao và sử dụng nấm men cố định [83, 193, 214].
Trong đĩ, phương án sử dụng nấm men cố định là phương án cho hiệu quả cao nhất. Nếu sử dụng nấm men cố định thì sẽ bỏ qua được giai đoạn tách nấm men phức tạp này và làm giảm thời gian tách cặn nấm men xuống chỉ cịn vài giây. Việc sử dụng kỹ thuật này cĩ nhiều ưu điểm liên quan đến chi phí, khả năng kiểm sốt quá trình lên men và giảm thiểu tối đa thời gian. Bên cạnh đĩ, quá trình lên men cũng diễn ra dễ dàng hơn do các tế bào nấm men được bảo vệ một phần khỏi độc tính của ethanol [193].
Fumi và cộng sự (1988, 1989) đã nghiên cứu về việc sử dụng nấm men cố định trong gel alginate trong sản xuất rượu vang cĩ gas và kết luận rằng [71, 72]:
− Sử dụng nấm men cố định khơng gây ra bất cứ sự thay đổi đáng kể nào trong quá trình lên men.
− Các thành phần chính như ethanol, acid hữu cơ, nitơ tổng và rượu bậc cao khơng cĩ sự khác biệt đáng kể khi so sánh rượu vang tạo ra bởi nấm men cố định và rượu vang tạo ra bởi nấm men tự do.
Tuy nhiên, ngay cả nếu như rượu vang thực sự trong suốt thì vẫn cĩ các tế bào tự do bị thốt ra khỏi hạt gel. Nếu các tế bào nấm men thốt khỏi hạt gel ra ngồi mơi trường, chúng sẽ tồn tại trong rượu vang và cĩ thể lên men lượng đường được bổ sung vào để điều chỉnh độ ngọt của sản phẩm cuối cùng. Cĩ thể thêm acid sorbic và SO2 như là tác nhân bảo quản trong trường hợp nấm men tự do cịn sĩt lại. Tuy nhiên, việc bổ sung chất này cĩ thể gây ra mùi vị khơng ưa thích [214].
Vì thế, cần cĩ các biện pháp khác để khắc phục hiện tượng tế bào thốt ra khỏi hạt gel. Hiện tượng tế bào thốt ra khỏi hạt gel diễn ra là do ban đầu trong hạt mật độ nấm men thấp, sau đĩ do tốc độ sinh trưởng cao đã làm giải phĩng ra một lượng CO2 khổng lồ làm phá vỡ các hạt nấm men cố định. Sự phá vỡ hạt diễn ra càng nhiều khi lượng hạt thêm vào chai càng thấp [193].
Do đĩ, theo Gịdia và cộng sự (1991), trở ngại này cĩ thể được khắc phục dựa trên cơ sở của thuyết sau: nếu mật độ tế bào nấm men ban đầu trong chai đủ cao và tính chất vật lý của hạt (chủ yếu là khả năng khuếch tán đường và kích thước hạt) đủ tốt để thời gian cần thiết cho việc đạt được các điều kiện đồng nhất trong tất cả các hạt ngắn hơn thời gian pha lag của nấm men, thì tổng hàm lượng đường cĩ trong rượu vang (18g/ chai) sẽ được sử dụng trước khi sự phân chia đồng bộ của các tế bào diễn ra. Nĩi cách khác, nếu tính đồng nhất của hạt đạt được đủ nhanh, thì lượng đường cĩ sẵn cho mỗi tế bào sẽ khơng đủ cho việc phân chia và do đĩ nấm men sẽ khơng thốt ra khỏi hạt gel [83, 193].
Ngồi ra, theo Martynenko và cộng sự (2004), để khắc phục hiện tượng này, cĩ thể bổ sung thêm vào rượu vang 2-(4-hydroxyphenyl)-ethanol để ức chế sự sinh trưởng và quá trình sinh sơi nảy nở của các tế bào nấm men mà khơng làm ảnh hưởng đến khả năng lên men [137].
Tuy nhiên, cũng theo Gịdia và cộng sự (1991), cách tốt nhất vẫn là sử dụng nấm men cố định 2 lớp, cĩ nghĩa là cĩ thêm lớp áo gel ở bên ngồi. Trong trường hợp này, do cĩ hàng rào gel nên đã ngăn cản được nấm men thốt ra khỏi hạt gel. Yokotsuka và cộng sự đã nghiên cứu và cũng cho kết luận tương tự (1997) [214].
Ngồi ra, cũng cĩ thể cố định nấm men bằng màng vi lọc để lên men theo phương pháp