19. Polymer tổng hợp: polyacrylamide, polyurethane và polyvinyl chloride [138]
2.2.3Cố định nấm men trong gel alginate
2.2.3.1 Alginate
Alginate cĩ khá nhiều trong tự nhiên và cĩ thể xuất phát từ 2 nguồn gốc khác nhau [186]:
− Là thành phần cấu trúc của tảo nâu biển (Phaeophyceae), chiếm đến 40% khối lượng chất khơ.
− Là polysaccharide màng bao trong các loại vi khuẩn đất.
Tuy nhiên tất cả các alginate thương mại hiện nay đều cĩ nguồn gốc từ tảo.
Alginate là một copolymer khơng phân nhánh, bao gồm các monomer β-D-mannuronic acid (gọi tắt là M) và α-L-guluronic acid (G) liên kết với nhau thơng qua liên kết 1,4 – glucoside. Các monomer này phân bố trong mạch alginate theo các block (Hình 2 .6) [116, 181, 186]:
− Block M: gồm các gốc mannuronic acid nối tiếp nhau − Block G: gồm các gốc guluronic acid nối tiếp nhau
− Block MG: gồm các gốc mannuronic acid và guluronic acid luân phiên nối với nhau.
Hình 2.6: Cấu trúc của alginate: (a) các monomer của alginate, (b) chuỗi alginate, (c) sự phân bố các block[186]
2.2.3.2 Cơ chế tạo gel
Alginate cĩ khả năng tạo gel khi kết hợp với các cation kim loại hĩa trị cao hoặc khi phân tử alginate bị acid hĩa. Tuy nhiên, phương pháp tạo gel bằng cách acid hĩa phân tử alginate ít được dùng vì quy trình thực hiện rất phức tạp [186].
Alginate cĩ khả năng kết hợp nhanh với các cation kim loại hĩa trị cao để tạo thành gel đồng thể. Aùi lực của alginate đối với các ion hĩa trị 2 khác nhau giảm theo trình tự: Pb2+ > Cu2+ > Cd2+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Co2+, Ni2+ > Zn2+ > Mn2+. Tùy thuộc vào loại ion liên kết và loại alginate mà gel tạo thành cĩ tính chất khác nhau. Thơng thường, người ta thường sử dụng calcium để làm ion tạo gel [144, 181].
Quá trình tạo gel của alginate theo phương pháp kết hợp với cation kim loại hĩa trị cao cĩ thể tiến hành theo 2 phương pháp là phương pháp tạo gel từ bên ngồi và phương pháp tạo gel từ bên trong [186].
• Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên ngồi
Đây là phương pháp tạo gel phổ biến nhất của alginate. Phương pháp này cĩ ưu điểm là tạo gel nhanh và thao tác rất đơn giản (Hình 2 .7).
Khi nhỏ dung dịch alginate vào dung dịch cĩ chứa cation cĩ khả năng tạo gel (thường gặp nhất là Ca2+), bề mặt ngồi của hạt alginate sẽ lập tức bị gel hĩa. Tiếp theo đĩ, các cation tạo gel ở bên ngồi hạt alginate tiếp tục khuếch tán vào bên trong hạt làm cho các phân tử alginate bên trong tiếp tục bị gel hĩa. Quá trình này xảy ra trên bề mặt hạt và phát triển vào bên trong. Phương pháp này tạo gel nhanh, tuy nhiên tính đồng thể của hạt gel lại khơng cao [100, 186, 193].
Hạt gel Cacium Alginate Na- Alginate Ca Ca Ca Ca Ca Ca CaCl2 Na-Alginate Lực đẩy
• Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên trong
Cho các muối cĩ chứa các cation tạo gel ở dạng vơ hoạt (Ví dụ: CaCO3, CaSO4, EDTA- Ca, calcium citrate…) vào dung dịch alginate. Thay đổi pH của dung dịch về pH acid bằng các tác nhân acid hĩa (Ví dụ: D-glucono-δ-lactone (GDL)). Khi đĩ, do pH giảm, mà độ hịa tan của các muối chứa các cation tạo gel như ở trên lại phụ thuộc vào pH nên các ion Ca2+
sẽ được giải phĩng dần và tham gia vào quá trình tạo gel với alginate (Hình 2 .8). Phương pháp này cho hạt gel cĩ tính đồng thể cao hơn hẳn phương pháp khuếch tán do các ion Ca2+
phân bố đồng đều hơn. Hơn thế nữa, phương pháp này cịn cĩ thể tạo gel với các hình dạng khác nhau như mong muốn bằng cách cho dung dịch alginate vào khuơn thích hợp trước khi quá trình tạo gel diễn ra. Trong khi đĩ, phương pháp tạo gel từ bên ngồi thường chỉ tạo thành các hạt cĩ hình cầu [67, 100, 101, 186]. H2O GDL H+ CO2 HCO3 CaCO3 H+ Ca Ca Ca Na-Alginate
Hình 2.8: Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên trong[186]
Theo Anders Johansen và James M. Flink (1986), khi nấm men được cố định theo phương pháp gel từ bên trong, tốc độ lên men cao hơn và độ bền gel khơng giảm trong suốt quá trình lên men khi so sánh với nấm men được cố định theo phương pháp tạo gel từ bên ngồi [100, 101].
2.2.3.3 Ưu nhược điểm của việc cố định nấm men trong gel alginate
• Ưu điểm
− Quá trình cố định dễ thực hiện [10, 35, 102, 103, 115, 176, 192, 194, 209].
− Điều kiện cố định ơn hịa, khơng phải xử lý nhiệt hay xử lý hĩa chất. Do đĩ, các tế bào cố định khơng bị mất hoạt tính [10, 35, 102, 103, 115, 176, 209, 211].
− Alginate là chất mang trơ về mặt hĩa học [176].
− Alginate khơng cĩ độc tính, thích hợp cho các sản phẩm thực phẩm [10, 103, 169, 176, 192].
− Gel alginate vẫn giữ được độ bền khi nhiệt độ lên men cao [205].
• Nhược điểm và cách khắc phục (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
− Độ bền gel giảm theo thời gian lên men do [113, 114, 115, 176, 194, 209, 211]:
• Các tế bào nấm men trên và gần bề mặt cĩ khả năng sinh sơi nảy nở chiếm ưu thế so với các tế bào nằm sau bên trong hạt, do đĩ cĩ thể làm phá vỡ bề mặt hạt gel và dễ dàng thốt ra khỏi hạt gel, phát triển nhanh chĩng trong mơi trường dưới dạng các nấm men tự do. Điều này làm cản trở việc đánh giá động học phản ứng của nấm men cố định, đồng thời gây khĩ khăn cho việc tách nấm men ra khỏi mơi trường lên men. Để khắc phục vấn đề này cĩ nhiều cách khác nhau. Cách thứ nhất là sử dụng kỹ thuật tạo màng bao. Trong phương pháp này, các tế bào sẽ được nhốt bên trong một nhân lỏng được bao bọc bởi một lớp mỏng gel alginate. Do đĩ, các tế bào sẽ cĩ khoảng khơng nhiều hơn để phát triển bên trong nhân lỏng. Vì thế, mật độ tế bào đạt được cao hơn mà khơng bị thốt bào ra ngồi. Hơn thế nữa, bằng cách này cĩ thể sử dụng lượng alginate ít hơn. Cách thứ hai là áo nấm men cố định với mạng polymer, cĩ thể thực hiện một bước (bằng cách sử dụng vịi đơi), hoặc hai bước (bằng cách tạo lớp áo polymer sau khi đã tạo hạt nấm men cố định). Đây là phương án rất khả thi vì nĩ khơng làm ảnh hưởng đến tốc độ sinh tổng hợp cồn cũng như tốc độ sử dụng cơ chất.
• Sự giải phĩng CO2 bên trong gel làm phá vỡ cấu trúc của gel. Để khắc phục, cĩ thể làm tăng độ xốp của gel alginate bằng cách giảm nồng độ alginate sử dụng, tuy nhiên điều này lại đồng nghĩa với việc làm yếu mạng gel. Vì thế, phải tăng độ bền gel bằng cách áo các hạt alginate xốp này với màng polymer (ví dụ, chitosan), khi đĩ độ bền của gel này sẽ tương tự với gel sử dụng nồng độ alginate cao.
− Gel Ca-alginate rất nhạy với các chất tạo chelate (hợp chất hữu cơ trong đĩ nguyên tử tạo thành nhiều hơn một liên kết phối trí với các kim loại trong dung dịch) như phosphate, citrate và lactate và các chất khơng tạo gel (non-gelling) như là các ion sodium và magnesium. Sự cĩ mặt của các ion này trong dung dịch sẽ làm cho các hạt bị phồng ra, dẫn đến tăng kích thước các lỗ xốp, làm giảm tính ổn định và phá vỡ cấu trúc hạt gel. Thơng thường người ta thường thêm vào mơi trường lên men các chất ổn định gel như là CaCl2, celite và pectine với một hàm lượng thích hợp để ổn định độ bền gel. Hoặc cũng cĩ thể làm cứng gel bằng cách sử dụng propylene glycol ester, polyethelenine (PEI) và các loại vật liệu composite (colloidal silica) [10, 102, 103, 144, 193, 194].
− Khơng bền hĩa học trong dung dịch điện phân và dung dịch cĩ pH cao. Để khắc phục điều này, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và cĩ nhiều phương pháp được đưa ra: tạo liên kết của hạt gel với glutaraldehyde (Takata và cộng sự, 1977), với polycations (Birnbaum và cộng sự, 1981) và sấy khơ hạt gel (Klein và Wagner, 1978; Burns và cộng sự, 1985). Những phương pháp này đều cĩ thể cải thiện độ bền trong dung dịch điện phân, nhưng rõ ràng là chúng rất phức tạp và tốn nhiều thời gian. Một số tác giả đã đưa ra phương pháp khác là dùng các ion Ba2+ và Sr2+ thay cho ion Ca2+ truyền
thống. Các ion này cĩ ái lực mạnh hơn đối với alginate, vì thế hạt gel barium và strontium alginate bền hơn trong dung dịch điện phân so với hạt gel calcium alginate. Tuy nhiên, các ion này vẫn khơng được ứng dụng rộng rãi vì độc tính của nĩ đối với nấm men và với mơi trường [144, 183, 192, 193, 194].
2.2.3.4 Ảnh hưởng của thành phần alginate và các điều kiện tạo gel đến độ bền gel và quá trình lên men
• Aûnh hưởng của khối lượng phân tử
Anders Johansen và James M. Flink (1986) đã nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử alginate thơng qua các thí nghiệm với các loại alginate cĩ độ nhớt khác nhau. Kết quả cho thấy rằng khối lượng phân tử ít cĩ ảnh hưởng đến tốc độ lên men và sự tạo thành ethanol, mặc dù tốc độ lên men nhìn chung giảm khi tăng khối lượng phân tử. Trong khi đĩ, độ bền gel (được đo bằng khả năng chống chịu đối với lực nén ép) tăng đáng kể khi tăng độ nhớt từ 5 đến 70cP (độ nhớt là đại lượng đặc trưng cho khối lượng phân tử của alginate), nhưng khi độ nhớt tăng cao hơn nữa (250 đến 600cP) thì độ bền gel tăng rất ít [101].
Kazuaki và cộng sự (1995) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của độ nhớt đến khả năng khuếch tán của glucose và kết quả cho thấy rằng khả năng khuếch tán của glucose khơng phụ thuộc vào độ nhớt. Trong quá trình xử lý nhiệt, độ nhớt của alginate giảm do giảm mức độ polymer hĩa của các phân tử alginate. Như vậy, việc tiệt trùng alginate khơng ảnh hưởng bất lợi đến khả năng khuếch tán của glucose [210].
• Aûnh hưởng của tỷ lệ G/M
Tỷ lệ G/M là phần mol của L-guluronic acid trên D-mannuronic acid, biểu thị thành phần của alginate.
Khi tỷ lệ G/M giảm thì:
− Tốc độ lên men cĩ xu hướng tăng, nhưng khơng đáng kể [101].
− Độ bền gel giảm, vì các ion hĩa trị 2 như là calcium, barium, strontium được ưu tiên liên kết vào block G hơn là block M và block MG. Do đĩ alginate cĩ hàm lượng G lớn sẽ tạo thành gel xốp, chắc hơn và vẫn giữ được độ cứng vững trong một thời gian dài. Trong suốt quá trình tạo liên kết với Ca2+, các loại alginate này sẽ khơng bị phồng nở hay co rút, vì thế vẫn giữ được hình dạng tốt hơn. Thêm vào đĩ, alginate cĩ hàm lượng G cao sẽ cản trở sự sinh trưởng của tế bào nấm men sau khi cố định. Trái lại, alginate cĩ hàm lượng M cao tạo thành gel mềm và ít xốp hơn và dễ bị rã ra hơn so với các gel giàu G [101, 116, 144, 173, 181, 192, 193]. Kazuaki và cộng sự (1995) cũng đã nghiên cứu và kết luận rằng gel alginate giàu G thích hợp để cố định nấm men hơn vì gel này ít gây cản trở đến khả năng khuếch tán của glucose và cĩ độ bền cơ học cao hơn [210].
• Aûnh hưởng của nồng độ alginate
Tăng nồng độ alginate trong khoảng 1 – 10% làm giảm đáng kể tốc độ lên men và tốc độ sinh tổng hợp cồn do làm giảm sự khuếch tán nhưng lại làm tăng độ bền gel [101, 146, 205, 210].
Theo nhiều nhà nghiên cứu, nồng độ alginate thích hợp để cố định nấm men là 2% [101, 146, 210].
• Aûnh hưởng của pH tạo gel
Theo Kazuaki và cộng sự (1995), pH của dung dịch alginate thích hợp cho quá trình tạo gel là từ 6,0 đến 8,0. Nằm ngồi khoảng này, khả năng khuếch tán của glucose và độ bền gel đều giảm. Đĩ là do pH đã làm thay đổi hình dạng của các phân tử alginate [210].
• Aûnh hưởng của nhiệt độ tạo gel
Theo Kazuaki và cộng sự (1995), khi nhiệt độ tạo gel dưới 298K, khả năng khuếch tán của glucose gần như khơng đổi, nhưng khi tăng nhiệt độ trên 300K thì khả năng khuếch tán của glucose giảm nhanh. Độ bền gel cũng gần như khơng đổi khi nhiệt độ tạo gel dưới 298K, nhưng giảm nhanh khi tăng nhiệt độ trên 300K. Nhiệt độ tạo gel ảnh hưởng đến khả năng khuếch tán của glucose và độ bền gel là do nhiệt độ đã làm thay đổi hình dạng của phân tử alginate. Như vậy, nhiệt độ thích hợp cho quá trình tạo gel là nhiệt độ dưới 298K [210].
• Aûnh hưởng của mật độ tế bào trong hạt
Để đánh giá ảnh hưởng của mật độ tế bào, Anders Johansen và James M. Flink (1986) đã tiến hành thí nghiệm với 2 mật độ tế bào là 0,5% và 10% (tương ứng với 2.108 và 4.109 tế bào/ g gel). Kết quả cho thấy rằng khi mật độ tế bào ban đầu cao, tốc độ lên men/ g hạt thì cao hơn nhưng năng suất/ tế bào thì thấp hơn so với mật độ tế bào ban đầu thấp. Đĩ là do sự cĩ mặt của lớp bề mặt tế bào hoạt hĩa ngay sát bề mặt hạt gel, tương tự như với nghiên cứu của Wada và cộng sự (1979) đối với các hạt κ-carrageenan. Lớp tế bào này làm ngăn cản sự khuếch tán của cơ chất và/ hoặc sản phẩm xuyên qua mạng gel, và do đĩ các tế bào bên trong gần như bị bất hoạt. Trong trường hợp này, năng suất/ tế bào thấp khi mật độ tế bào cao đĩ là do các tế bào nằm ở bên dưới lớp bề mặt cũng được tính vào mật độ tế bào nhưng khơng tham gia vào quá trình tạo thành sản phẩm [101].
• Aûnh hưởng của tỷ lệ S/V
Diện tích bề mặt riêng (diện tích bề mặt/ thể tích) là một yếu tố quan trọng đối với năng suất lên men/g hạt, khi tỷ lệ S/V càng cao thì năng suất càng cao. Đối với một tỷ lệ S/V nhất định, hình dạng gel khơng ảnh hưởng đến tốc độ lên men [101].