trường sử dụng .
* Lý do lựa chọn phương pháp nuơi cấy nguyên phát sau các lần thí nghiệm tổng quát: Do ở phương pháp này cĩ ưu điểm chủ yếu là duy trì được lâu dài các dịng tế bào sơ cấp để quan sát, so sánh ; mặc dù nĩ cĩ khuyết điểm là mọc chậm và chậm mọc hơn từ 1 – 2 ngày so với phương pháp tách bằng trypsin và tách từ dịch rửa. Tế bào nuơi bằng phương pháp nguyên phát nĩ cĩ khả năng chống chịu cao trước sự biến động của mơi trường như: cĩ thể mọc và phát triển dưới điều kiện khơng cĩ CO2 5% ,và ủ ở 36,5oC trong hơn một tuần (9 ngày). Tế bào nuơi bằng phương pháp nguyên phát vẫn mọc và phát triển tốt trong khi sai kỳ hạn thay mơi trường lên đến ba ngày. Song song đĩ, phương pháp tách bằng trypsin, do từ đầu tế bào đã bị tác động bởi hĩa chất nên chỉ sau
ba ngày sai kỳ hạn thay mơi trường, dề lớp đơn tế bào đã bong chốc và chết hầu hết, chỉ cịn lại hai cụm lác đác vài tế bào. Lưu ý, hầu hết khả năng chịu sự biến động đĩ diễn ra trên mơi trường AMNIOMAXTM-C100 20% FBS.
Nuơi cấy tế bào từ dịch rửa, khả năng chịu sự biến động của điều kiện mơi trường nuơi cấy cũng cao, nhưng bị tác động (stress) lần thứ hai, như là, khơng thay mơi trường đúng kỳ hạn thì hầu hết lớp đơn mọc lan bong ra, rồi chết, giống y như trong trường hợp tách bằng trypsin. Và dù sau đi nữa, phương pháp nuơi cấy từ dịch rửa cũng chỉ là một hình thức tiết kiệm, tận dụng nguồn mẫu trong điều kiện hiếm hoi mẫu thí nghiệm. Và do đĩ khơng được lựa chọn và đánh giá là phương pháp tối ưu.
Ưu điểm duy nhất của phương pháp tách bằng trypsin là thu được một lượng lớn tế bào rời , nhanh mọc (biểu hiện sự mọc chỉ sau 24 giờ) và tốc độ mọc nhanh, đồng loạt, Các dịng tế bào của phơi tách bằng trypsin ngay từ đầu đã thể hiện sự đa dạng về hình thái của tế bào. Trong khi nuơi nguyên phát và nuơi từ dịch rửa, sự đa dạng các dịng tế bào chỉ biểu hiện: khi mật độ tế bào mọc lan tỏa trở nên cao (từ 70% - 80%) ; và khi bị tác động bởi sự biến động của mơi trường như: khơng cịn chỗ trống để mọc lan tỏa, hoặc nguồn dinh dưỡng cạn kiện dần đến mức độ hiếm hoi, và bị tác động bởi trypsin.
Vì những lý do nêu trên, trong điều kiện nghiên cứu mang tính chất mơ tả thử nghiệm: khảo sát, mơ tả, so sánh tế bào, nên phương pháp nuơi cấy nguyên phát được lựa chọn để khảo nghiệm.
Mục đích cuối cùng trong tiến trình thí nghiệm của chúng tơi gồm ba cấp độ:
Cấp độ 1: Nuơi cho bằng được tế bào mọc bám, lan rộng và duy trì được các dịng tế bào đĩ phát triển trong giới hạn tuổi đời thế hệ của chúng.
Cấp độ 2: Xác định được tế bào mục tiêu để ghi nhận hình ảnh; xác nhận chính xác hình dạng, đặc điểm của tế bào mục tiêu dạng nguyên bào sợi trong chai cấy – đối tượng cần phân lập và để đi đến tạo dịng.
Cấp độ 3: Phân lập và tạo dịng thuần nguyên bào sợi.
Và cuối cùng kết quả của chúng tơi chỉ dừng lại ở mức giữa chừng của cấp độ hai. Vì lý do kinh phí và thời gian hạn hẹp
Bên cạnh những thành cơng là nuơi được tế bào mọc theo mục tiêu cơ bản đã đề ra, đã giữ được tế bào đạt đến mật độ cao, 90% - 100% diện tích bề mặt chai nuơi và đã cấy chuyền được; và rồi mọc tốt mà khơng cĩ dấu hiệu bị nhiễm; song song đĩ cũng cĩ những hạn chế nhất định:
+ Chỉ nhận diện được tế bào ở mức độ so sánh hình ảnh các tế bào mục tiêu ghi nhận được với tế bào nguyên bào sợi của các tác giả nước ngồi ghi nhận bằng kính hiển vi điện tử quét hay khính hiển vi quang học, hoặc nhận diện thơng qua các khái niệm, định nghĩa về đặc điểm hình thái của nguyên bào sợi trong quá trình quan sát mà khơng xác định được chắc chắn 100% trên mẫu nuơi cấy đâu là nguyên bào sợi thơng qua dấu ấn tế bào (bộ Kít thử marker bề mặt). Cĩ nghĩa là kết quả thí nghiệm chỉ dừng lại ở mức độ khảo sát, so sánh, định tính mà khơng đạt đến mức độ định lượng. Do đĩ, mật độ tế bào mục tiêu xác định được trên mơi trường nuơi cấy chỉ dừng lại ở mức độ tương đối, những mục tiêu được xác định đĩ là tế bào bám đáy, tạo thành lớp đơn, và cĩ khả năng mọc đơn lẽ.
+ Do số lần cấy truyền chỉ dừng lại ở mức độ n = 1, cho nên chưa tạo ra được dịng tế bào thuần duy nhất, mặc dù số lượng về độ dạng của tế bào cĩ giảm xuống hoặc cĩ sự biến đổi và cĩ xuất hiện dạng tế bào mới.
* Trong các đợt nuơi cấy, kết quả thí nghiệm cho thấy, mơi trường AMNIOMAX cho phép các dịng tế bào mọc rất tốt, nhất là dịng tế bào nguyên
bào sợi. Do ngay từ đầu, về bản chất của mơi trường, đây là mơi trường giàu dinh dưỡng, mơi trường thương mại chuyên cho nuơi cấy nguyên bào sợi từ nước ối (15-16 tuần tuổi) để chẩn đốn bệnh di truyền của thay nhi trước sinh [Phịng di truyền, bệnh viện Từ Dũ], nên các tế bào mọc trên mơi trường này là rất tốt, đặc biệt đối với nuơi cấy sơ cấp. Đĩ là điều hiển nhiên, khơng cịn gì để bàn cải, Nhưng duy nhất một điểm hạn chế của nĩ là đắc tiền
Mục đích so sánh mơi trường của chúng tơi là khảo sát xem: mơi trường cơ bản (như: DMEM, EMEM), nĩ cĩ cho các dịng tế bào, cũng như dịng nguyên bào sợi phát triển được và phát triển tốt hay khơng. Để xem chúng ta cĩ thể nuơi nguyên bào sợi mọc tốt trên các mơi trường cơ bản này như là các tác giả khác trên thế giới đã từng nuơi cho nĩ mọc tốt hay khơng. Và nếu nguyên bào sợi cĩ thể mọc tốt trên mơi trường cơ bản thì cần liều lượng và kỳ hạn thay mơi trường là bao nhiêu thì tối ưu. Nếu chúng ta cĩ thể nuơi nguyên bào sợi mọc tốt trên hai mơi trường cơ bản trên thì từ đĩ chúng ta cĩ thể tiết kiệm được chi phí nuơi cấy, chi phí nghiên cứu, và cĩ thể hạ giá thành sản phẩm trong trường hợp kết quả nghiên cứu đi tới ứng dụng sản xuất, tạo sản phẩm thương mại. Nhưng ngay từ đầu, chúng ta đã xác định khơng đúng liều lượng cần thiết và kỳ hạn thay mơi trường phù hợp để cho các tế bào sơ cấp cĩ thể mọc và duy trì sự phát triển của nĩ trên hai loại mơi trường cơ bản đĩ. Với 1ml EMEM hoặc 1ml DMEM ứng với một ngày nuơi rồi mới thay mơi trường là quá ít, và là khơng đủ dinh dưỡng để cho tế bào phát triển và tăng trưởng. Bằng chứng rõ ràng là trong các lần nuơi , từ đầu tế bào đã mọc trên tất cả các loại mơi trường, cĩ dấu hiệu tăng trưởng, nhưng chỉ sau từ 3 -7 ngày nuơi thì dấu hiệu phát triển chấm dứt và tàn lụi trên hai loại mơi trường cơ bản. Điều này thể hiện rõ ràng nhất ở phương pháp nuơi nguyên phát và nuơi từ dịch rửa, với cách áp dụng kiểu thay mơi trường: ngày 1 thay 1 ml mơi trường, ngày 2 thay 2 ml mơi trường, … , ngày 5 thay 5 ml mơi trường, và rồi duy trì mãi cách thay: cứ 5 ml mơi trường thì 5
ngày sau thay, cho đến khi kết thúc mẫu thí nghiệm. Chính vì lẽ đĩ, mà duy chỉ cĩ mơi trường AMNIOMAX là mơi trường giàu dinh dưỡng cho phép các tế bào mọc bám , lan rộng, phát triển tiếp sau 7 ngày nuơi cấy (tính từ ngày cấy).
5.Các yếu tố liên quan ảnh hưởng đến kết quả tiến trình thí nghiệm
*./ Thiếu CO2 hơn một tuần trong nuơi cấy
Trong thí nghiệm Đợt I, lần thứ nhất, mặc dù mẫu chai cấy thiếu CO2 5% và tiếp diễn trong 9 ngày liên tiếp mà chỉ ủ ở nhiệt độ 36,5oC nhưng tế bào vẫn mọc bám và phát triển tốt; đặc biệt là ở chai nuơi nguyên phát và dịch rửa. Lý do giải thích cho điều này là: nuơi mơ từ phương pháp nguyên phát và từ dịch rửa, tế bào ngay từ đầu khơng bị tác động bỡi hĩa chất, khả năng cảm ứng chuyển dạng, khả năng đáp ứng với sự biến động mơi trường vẫn cịn nguyên vẹn trên màng tế bào. Hơn nữa, nguyên bào sợi là loại tế bào mọc bám rất tốt so với các loại tế bào khác, trong cơ thể , tế bào nguyên bào sợi đĩng vai trị chủ yếu trong quá trình sử a chửa và làm lành hĩa vết thương. [12],[13],[30] *./ Ảnh hưởng của hĩa chất.
Tiến hành khử trùng tủ nuơi thì cần phải để cách ly, để thĩang tủ nuơi trong khoảng thời gian dài (ít nhất một tuần) rồi mới sử dụng tủ nuơi ủ mẫu cấy . Nếu khơng sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào ủ trong tủ .
*./ Ảnh hưởng của nguồn mẫu khơng ổn định.
Cĩ lần cấy mà khơng thu được phơi từ nguồn mẫu đem về. Như ở Đợt III lần 1.
6. Những thuận lợi trong tiến trình thí nghiệm.
Do mẫu lấy từ nguồn phơi thai ngồi thơng qua mổ đường bụng trong điều kiện phịng vơ trùng nên đã hạn chế gần 100% nguy cơ nhiễm mẫu cấy từ nguồn mẫu lấy ở bệnh viện phụ sản Từ Dũ.
Do áp dụng qui trình vơ trùng của Ngân Hàng Mơ thuộc Bộ mơn Mơ Phơi - Trung tâm Đào tạo Cán Bộ Y Tế Thành phố Hồ Chí Minh nên nguy cơ nhiễm từ quá trình thao tác đã hạn chế và kiểm sốt được.
Nhờ vào hai lý do trên mà quá trình thí nghiệm của chúng tơi tại Bộ mơn Mơ Phơi - Trung tâm Đào tạo Cán Bộ Y Tế Thành phố Hồ Chí Minh đã kiểm sốt được sự nhiễm trong suốt quá trình nuơi cấy.
7. So sánh hình dạng các loại tế bào dạng nguyên bào sợi.
A./ So sánh đặc điểm hình thái của tế bào nuơi cấy được từ mơ phơi người với tế bào nuơi cấy được từ mơ phơi chuột và với tế bào nuơi cấy được từ gai nhau.
Hình 36: Ảnh tế bào từ phơi chuột. Nguyễn Lê Xuân Trường (0018200)
Hình 37: Ảnh tế bào từ phơi người, Đợt II lần 2
B./ So sánh đặc điểm hình thái của tế bào trung mơ nuơi cấy được với các lọai tế bào khác và với tế bào trung mơ chụp dưới kính hiển vi điện tử quét.
Hình 42: Tế bào mục tiêu và tế bào dạng đặc biệt
Hình 43: Tế bào mục tiêu và tế bào dạng đặc biệt Hình 41: Ảnh dịng tế bào trung mơ[39]
Hình 46: Ảnh các dạng tế bào đặc biệt. Hình 45: Ảnh các dạng tế bào đặc biệt.
Hình 48: Ảnh các dạng tế bào đặc biệt. Hình 47: Ảnh các dạng tế bào đặc biệt.
C./ So sánh đặc điểm hình thái của nguyên bào sợi nuơi cấy được với các lọai tế bào khác và với nguyên bào sợi chụp dưới kính hiển vi điện tử quét.
Hình 49: Ảnh nguyên bào sợi
Dưới kính hiển vi điện tử quét [10] Hình 50: Ảnh nguyên bào sợi.
Hình 52: Ảnh nguyên bào sợi. Hình 51 : Ảnh nguyên bào sợi
Trang 98
Û
Hình 54: Ảnh nguyên bào sợi phác họa và ghi nhận[9] Hình 53:
Tế bào sợi ghi nhận và phác họa[9]
Hình 55: Ảnh nguyên bào sợi dưới kính hiển vi điện tử.[10]
Hình 56:Tế bào dạng nguyên bào sợi sau cấy chuyền.
Hình 57:Tế bào dạng nguyên bào sợi trước cấy chuyền.
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I./. KẾT LUẬN:
Như vậy, trong kết quả nghiên cứu này, đã xác định được một số vấn đề cụ thể như sau:
Tai vịi chứa đựng thai ngồi tử cung, do quá trình mổ nội soi và khi thai quá non tháng ( dưới 5 tuần tuổi) thì mẫu mơ rất khĩ xác định trên đại thể. Cĩ lần chúng tơi đã cấy mà khơng phải là mơ mục tiêu (cấy khơng đúng đối tượng nghiên cứu nên cĩ thể khơng cĩ tế bào mọc). Điều đĩ dược xác định sau khi đem một phần mẫu mơ ấy đi cắt lát khảo sát vi thể. (như ở Đợt III lần 1).
Trong ba phương pháp thì phương pháp nuơi nguyên phát mẫu mơ phơi thai sau khi tách bằng cơ học, để tạo những mảnh mơ 1-3 mm3 , cho kết quả nuơi tốt nhất so với hai phương pháp cịn lại. Thời gian tế bào sống và phát triển trong trường hợp nuơi nguyên phát thì lâu hơn so với hai phương pháp nuơi cịn lại.
Trong các loại mơi trường nuơi: AMNIOMAX, DMEM, EMEM thì mơi trường AMNIOMAX cho kết quả nuơi tốt nhất trong trường hợp nuơi sơ cấp so với hai mơi trường cịn lại.
Cịn trong trường hợp nuơi cấy thứ cấp thì mơi trường EMEM cho kết quả nuơi cũng khơng kém AMNOMAX. Trong quá trình cấy chuyền, hai mơi trường cơ bản: DMEM, EMEM đều cĩ pha thêm một ít AMNIOMAX với tỉ lệ 1:4. AMNIOMAX cĩ chứa huyết thanh được sử dụng để ức chế trypsin sau khi tế bào bị tác động trong lúc cấy chuyền. Kết quả tế bào sau cấy chuyền mọc trên mơi trường EMEM tốt hơn mơi trường DMEM ( cả hai cĩ pha thêm một ít AMNIOMAX, chỉ pha thêm trong lần cấp liệu mơi trường lần đầu tiên), và đồng thời tế bào mọc tốt hơn cả trường hợp tế bào nuơi trên mơi trường AMNIOMAX.
Cho đến lúc kết thúc thí nghiệm, tế bào sau cấy chuyền vẫn phát triển tốt (chỉ trừ trường hợp nuơi trên mơi trường DMEM).
II. ./ ĐỀ NGHỊ:
Do bị giới hạn về thời gian nên kết quả chúng tơi đạt được khá khiêm tốn, để đạt được kết quả cao hơn và để cĩ thể đi sâu vào hướng ứng dụng kết quả nuơi cấy vào thực tiễn, chúng tơi cĩ một số ý kiến để kiến nghị:
Chuẩn hĩa qui trình nuơi cấy, xác định thêm nữa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuơi cấy. kiểm nghiệm lại liều lượng mơi trừơng cơ bản đã được đề cập đến ở phần thảo luận.
Thử nghiệm nuơi cấy để xác định lại liều lượng và kỳ hạn thay mơi trường tối ưu cho trường hợp nuơi sơ cấp và thứ cấp trên hai loại mơi trường cơ bản:EMEM, DMEM.
Thử nghiệm nuơi Nguyên bào sợi từ các nguồn khác nhau để kiểm nghiệm lại khả năng và phương pháp hạn chế sự nhiễm.
Thử nghiệm phân lập và tạo dịng bằng phương pháp cấy chuyền liên tục và đồng thời so sánh với việc phân lập và tạo dịng trên mơi trường thạch, thực hiện cấy truyền và thu nhận nguyên bào sợi bằng vịng rings. Để từ đĩ, xác định mức độ ảnh hưởng của hĩa chất lên các tế bào nuơi cấy sơ cấp và các tế bào sau khi cấy chuyền.
Kiểm nghiệm lại tính ưu việt của sự pha trộn mơi trường nuơi cấy: AMNIOMAX + EMEM (tỉ lệ 1:4) , và sự pha trộn giữa FBS và AHS tác động, ảnh hưởng đối với tốc độ tăng trưởng của tế bào trong quá trình nuơi cấy sơ cấp và thứ cấp .
Sử dụng dấu ấn tế bào để xác định nguyên bào sợi bằng marker bề mặt, hĩa huỳnh quang miễn dịch.