1. KẾT QUẢ GHI NHẬN TRONG
1.2. KẾT QUẢ NUƠI CẤY THỨ CẤP – CẤY CHUYỀN
Thực hiện cấy chuyền từ chai cấy AMNIOMAX – nguyên phát ra ba loại mơi trường: AMNIOMAX, DMEM, EMEM cĩ bổ sung 20% huyết thanh. Sau 24 giờ, và cứ cách 24 giờ quan sát mẫu, đếm mật độ tế bào tại 5 vị trí trên chai cấy rồi lấy giá trị trung bình ở quang trường 10X. Ghi nhận hình ảnh của ba chai ở mỗi lần quan sát. Rồi chấm dứt thí nghiệm.
Mật độ tế bào khi tách bằng trypsin, trước khi cấy chuyền vào chai cấy mới (trước pha lỗng) là: 4,35.106 tế bào/ ml.
*./ Cách tính: Số tế bào đếm trong 5 ơ lớn:[Phụ lục B] A = 7; B = 10; C = 17; D = 10; E = 14. N = 7 + 10 + 17 + 10 + 14 = 58 tế bào/ 5 ơ lớn. N’ = 5*58 = 290 tế bào/buồng đếm. Mật độ tế bào/1ml: C = 290*104 tế bào/1ml. Với độ pha lỗng a = 1,5 lần thì: C’ = 1,5*290*104 = 4,35*106 tế bào/1ml.
*./ Pha lỗng để đủ thể tích cho vào ba chai cấy: Sử dụng 1,5 ml AMNIOMAXTM-C100 20% FBS là mơi trường dinh dưỡng cao, cĩ thành phần bổ trợ, cĩ chứa huyết thanh để ức chế trypsin trong lúc cấy truyền. Đem đếm mật độ cĩ: C’ = 4,35*106 tế bào/1ml. Bổ sung thêm 1,5 ml AMNIOMAXTM- C100 20% FBS nữa để được 3ml và chia đều cho ba chai cấy như sau:
+ Chai AMNIOMAX: 1ml dịch huyền phù (cĩ FBS) + 4ml AMNIOMAXTM-C100 20% FBS.
+ Chai DMEM: 1ml dịch huyền phù (cĩ FBS) + 4 ml DMEM 20% AHS.
+ Chai EMEM: 1ml dịch huyền phù (cĩ FBS) + 4 ml EMEM 20% AHS.
*./ Mật độ ở mỗi chai sau pha lỗng đem nuơi là:
C’’ = n/v = (0.5*4,35*106 / 5) = 0,435*106 (tế bào/5ml mơi trường). *./ Sau 24 giờ, sau khi cấy truyền (13/5), quan sát chỉ thấy lác đác vài tế bào ở cả ba chai; Cách 48 giờ (14/5) sau khi cấy truyền số lượng tế bào trên quang trường 10X, bắt đầu tăng lên đáng kể, bắt đầu quan sát và đếm mật độ. 1.3. Hình ảnh ghi nhận được trong các đợt nuơi cấy.
*./ Đợt I: Các hình ảnh tế bào nuơi cấy mọc lan ra mơ nguyên phát lần 1 đợt I.
Trang 73
*./ Đợt II: Các hình ảnh tế bào nuơi cấy mọc lan ra mơ nguyên phát lần 2 đợt II.
Trang 74
14.6
35%
16% 49%
AMNIOMAXTM-C100 20% FBS DMEM 20% AHS EMEM 20% AHS
*./ Đợt III: Các hình ảnh tế bào nuơi cấy mọc lan ra mơ nguyên phát lần 2 đợt III.
2. SỐ LIỆU VÀ HÌNH ẢNH GHI NHẬN ĐƯỢC SAU KHI CẤY TRUYỀN. 2.1.Bảng số liệu, và hình ảnh (ngày 14/6) 2.1.Bảng số liệu, và hình ảnh (ngày 14/6)
Bảng 3:
Vị trí trên chai / Mơi trường AMNIOMAX DMEM EMEM
1 4 1 4
2 2 0 2
3 1 1 3
4 1 1 4
5 3 2 2
Mật độ trung bình/quang trường 10X 2,2 1 3
Hình 29: Ảnh tế bào lan ra tư ø mơ, nuơi cấy sơ cấp
*./ Các ảnh minh họa cho các tế bào sau cấy chuyền, quan sát ngày 14/6. Thứ tự ảnh: A-D-E. (Ứng với: AMNIOMAX-DMEM-EMEM).
Hình 30: Ảnh nuơi cấy thứ cấp, 14/6: A-D-E
2.2. Bảng số liệu, và hình ảnh (ngày 15/6) Bảng 4:
Vị trí trên chai / Mơi trường AMNIOMAX DMEM EMEM
1 10 3 4
2 4 2 5
3 9 2 12
4 11 3 7
5 9 4 18
Mật độ trung bình/quang trường 10X 8,6 2,8 9,2
*./ Nhận xét 1:
Ngày đầu (14/6), số lượng tế bào đếm được ở trên ba mơi trường, cĩ độ chênh lệch khơng cao. Nhìn tổng thể, tế bào mọc trên các chai cấy là rất chậm (đã sau 48 giờ sau khi cấy chuyền), cĩ lẽ mật độ tế bào đem cấy chuyền khơng đạt tỉ lệ như yêu cầu (106 – 107). Nhưng tế bào mọïc bám trên mơi trường EMEM 20%AHS thì nhiều hơn so với hai mơi trường cịn lại, số lượng tế bào mọc trên mơi trường DMEM 20%FBS là ít nhất.
*./ Các ảnh minh họa cho các tế bào sau cấy chuyền, quan sát ngày 15/6. Thứ tự ảnh: A-D-E. (Ứng với: AMNIOMAX-DMEM-EMEM).
Hình 31: Ảnh nuơi cấy thứ cấp, 15/6: A-D-E *. Nhận xét 2:
Ngày 15/6, cách sau 72 giờ sau khi cấy chuyền. Mật độ tế bào trên quang trường 10X ở trường hợp mơi trường: AMNIOMAX và EMEM tăng lên rất đáng kể; duy chỉ mật độ tế bào trên quang trường 10X ở DMEM tăng lên rất chậm. Biểu đồ 2: 15.6 42% 14% 44%
2.3./ Bảng Số Liệu Và Hình Aûnh (Ngày 16/6) Bảng 5:
Biểu đồ 3
*./ Các ảnh minh họa cho các tế bào sau cấy chuyền, quan sát ngày 16/6. Thứ tự ảnh: A-D-E. (Ứng với: AMNIOMAX-DMEM-EMEM).
16.6
38%
11% 51%
AMNIOMAXTM-C100 20% FBS DMEM 20% AHS EMEM 20% AHS
*./ Nhận xét 3:
Ngày 16/6, cách sau 96 giờ sau khi cấy chuyền. Mật độ tế bào ở cả ba chai cấy đều tăng lên, nhiều nhất là mật độ tế bào trên mơi trường EMEM, kế đến là ở mơi trường AMNIOMAX, mật độ tế bào tăng ít nhất là ở mơi trường DMEM.
Vị trí trên chai / Mơi trường AMNIOMAX DMEM EMEM
1 15 4 16
2 7 3 15
3 12 4 20
4 13 3 13
5 13 3 18
Hình 32: Ảnh nuơi cấy thứ cấp, 16/6: A-D-E 2.4./ Bảng Số Liệu Và Hình Aûnh (Ngày 17/6)
Bảng 6 Biểu đồ 4 17.6 29% 3% 68%
AMNIOMAXTM-C100 20% FBS DMEM 20% AHS EMEM 20% AHS
*./ Quan sát xong, rồi thay mơi trường cho ba chai cấy truyền vào ngày 17/6.
Vị trí trên chai / Mơi trường AMNIOMAX DMEM EMEM
1 9 1 30
2 6 0 12
3 7 0 21
4 9 2 17
5 10 1 17
*./ Các ảnh minh họa cho các tế bào sau cấy chuyền, quan sát ngày 17/6. Thứ tự ảnh: A-D-E. (Ứng với: AMNIOMAX-DMEM-EMEM).
Hình 33: Ảnh nuơi cấy thứ cấp, 17/6: A-D-E *./ Nhân xét 4:
Ngày 17/6, cách sau 120 giờ sau khi cấy chuyền (tức là cách 5 ngày sau khi cấy chuyền, đến ngày cuối cùng của kỳ hạn thay mơi trường). Mật độ tế bào trên quang trường 10X ở mơi trường EMEM tăng lên, vượt trội. Trong khi đĩ mật độ tế bào trên quang trường 10X ở hai mơi trường: AMNIOMAX, DMEM giảm so với 24 giờ trước đĩ, cĩ lẽ do cạn kiệt nguồn dinh dưỡng mà chưa được bổ sung, và cộng thêm mơi trường trở nên cũ cũng là một nguyên nhân gĩp phần gây ảnh hưởng đến sự giảm xúc mật độ ở hai trường hợp trên. Cịn trường hợp, trên mơi trường EMEM cĩ nguồn dinh dưỡng dồi dào hơn mơi trường DMEM cĩ thể là do sự pha trộn giữa: 1ml AMNIOMAX và 4ml EMEM và đồng thời sử dụng huyết thanh người (AHS) làm chất bổ trợ trong mơi trường EMEM. Khi pha trộn hai mơi trường trên lại với nhau đồng nghĩa với sự kết hợp đồng thời hai hỗn hợp bổ trợ: FBS và AHS trong cùng một mơi trường. Cĩ lẽ, vì lẽ đĩ mà hỗn hợp các dịng tế bào, trong đĩ cĩ nguyên bào sợi phát triển rất tốt và tế bào mọc bám vượt trội trên EMEM được pha trộn, tốt hơn so với ngay cả tế bào mọc tên mơi trường AMNIOMAX.
2.5./ Bảng Số Liệu Và Hình Aûnh (Ngày 18/6) Bảng 7:
*./ Các ảnh minh họa cho các tế bào sau cấy chuyền, quan sát ngày 18/6. Thứ tự ảnh: A-D-E. (Ứng với: AMNIOMAX-DMEM-EMEM).
18.6
36% 6%
58%
AMNIOMAXTM-C100 20% FBS DMEMAH% AHS EMEM 20% AHS
*./ Nhận xét 5:
Ngày 18/6, tức là cách 1 ngày (24 giờ) sau khi thay mơi trường. Mật độ tế bào trên quang trường 10X ở cả ba mơi trường tiếp tục tăng so với ngày 1 trước đĩ (cách đĩ 24 giờ). Tế bào được phục hồi khả năng tăng sinh, do đĩ mật độ tế bào trên quang trường 10X ở mơi trường: AMNIOMAX, DMEM tăng lên mà khơng bị giảm xuống tiếp tục. Cịn mật độ tế bào trên quang trường 10X ở EMEM thì khơng ngừng được nhân lên.
Vị trí trên chai / Mơi trường AMNIOMAX DMEM EMEM
1 17 2 45
2 17 4 22
3 25 4 37
4 35 5 44
5 16 2 33
Mật độ trung bình/quang trường 10X 22 3,4 36,2
Hình 34: Ảnh nuơi cấy sơ cấp, 18/6: A-D-E 2.6./ Bảng Số Liệu Và Hình Aûnh (Ngày 21/6)
Bảng 8: Biểu đồ 6 21.6 37% 1% 62%
AMNIOMAXTM-C100 20% FBS DMEM 20% AHS EMEM 20% AHS
Vị trí trên chai / Mơi trường AMNIOMAX DMEM EMEM
1 21 1 39
2 400 1 100
3 13 1 200
4 23 2 150
5 11 2 300
Mơi trường 14/6 15/6 16/6 17/6 18/6 21/6 AMNIOMAX 2,2 8,6 12 8,2 22 93,6
*./ Các ảnh minh họa cho các tế bào sau cấy chuyền, quan sát ngày 21/6. Thứ tự ảnh: A-D-E. (Ứng với: AMNIOMAX-DMEM-EMEM).
II. BÀN LUẬN:
1. So sánh bảng số liệu trên cùng mơi trườngA. Trên Cùng Mơi Trường: Amniomax. A. Trên Cùng Mơi Trường: Amniomax. Bảng 9:
*./ Nhận xét 6:
Ngày 21/6, tức là cách 9 ngày (216 giờ) sau khi cấy chuyền, và cách 4 ngày (96 giờ) sau khi thay mơi trường lần thứ nhất, và cách 2 ngày khơng quan sát. Mật độ tế bào trên quang trường 10X ở mơi trường EMEM tăng vọt rất cao; cịn mật độ tế bào ở ở mơi trường AMNIOMAX cũng tăng, nhưng ít hơn so với ở EMEM. Duy chỉ mật độ tế bào trên quang trường 10X ở mơi trường DMEM lại tiếp tục giảm so với trước đĩ 2 ngày. Lý do giải thích cho điều này
2.2 8.6 12 8.2 22 93.6 0 20 40 60 80 100 14/6 15/6 16/6 17/6 18/6 AMNIOMAXTM-C100 20% FBS AMNIOMAXTM-C100 20% FBS 21/6 Biểu đồ 7:
B. Trên Cùng Mơi Trường: DMEM Bảng 10:
* Nhận xét 7:
Mật độ tế bào trên quang trường 10X ở mơi trường AMNIOMAX, nhìn chung khơng ngừng tăng lên theo thời gian (trừ trường hợp mật độ tế bào ngày 17/6). Điều đĩ chứng tỏ rằng mơi trường này phù hợp cho nuơi cấy nguyên phát (sơ cấp) và cho cả cấy chuyền tế bào nguyên bào sợi. Liều lượng 5 ml mơi trường AMNOOMAX ứng với 5 ngày nuơi tế bào là phù hợp. Duy nhất một điều cần lưu ý là khi tách tế bào bằng trypsin hay khi cấy truyền cĩ sử dụng tới trypsin thì kỳ hạn ngày thay mơi trường lần đầu tiên khơng được vượt quá 4 ngày đối với trường hợp mơi trường AMNIOMAX. Tốt nhất là trong khoảng từ 2 – 3 sau khi cấy tách bằng trypsin thì thay mơi trường lần thứ nhất. Cĩ thể mơi trường trong chai cấy luơn luơn cũ cũng gây ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của tế bào.
Mơi trường 14/6 15/6 16/6 17/6 18/6 21/6 DMEM 1 2,8 3,4 0,8 3,4 1,4
*./ Nhận xét 7:
Mật độ tế bào trên quang trường 10X ở mơi trường DMEM, cĩ tăng lên theo thời gian, nhưng rất chậm, sử dụng liều lượng mơi trường 5 ml ứng với 5 ngày thay là khơng phù hợp đối với mơi trường DMEM. Cĩ lẽ liều lượng mơi trường sử dụng ít so với nhu cầu phát triển của tế bào, khơng đủ dinh dưỡng cho tế bào tăng sinh.Trong khoảng 4 ngày đầu, mật độ tế bào trên mơi trường DMEM cĩ tăng, nhưng từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 5 thì mật độ tế bào giảm mạnh. Và điều đĩ lặp lại đến 2 lần, tiếp tục xảy ra sự giảm mật độ trong kỳ thay mơi trường lần thứ nhất. Cho mơi trường vào nuơi tế bào bắt đầu từ ngày 12/6, tế bào biểu hiện tăng sinh cho đến ngày 16/6, và đến ngày 17/6 mật độ tế bào giảm đột ngột. Thay mơi trường lần thứ nhất vào chiều ngày 17/6, đến ngày 18/6 tế bào biểu hiện tăng sinh trở lại; và đến ngày 21/6, tức là sau 4 ngày sau khi thay mơi trường, khi quan sát trở lại thì mật độ tế bào cĩ biểu hiện giảm, Chứng tỏ chỉ cĩ cách 4 ngày rồi thay mơi trường cũng khơng phù hợp. Vậy liều lượng mơi trường 5ml (DMEM) ứng với 5 ngày thay là khơng phù hợp. Biểu đồ 8 1 2.8 3.4 0.8 3.4 1.4 0 2 4 6 8 10 14/6 15/6 16/6 17/6 18/6 DMEM 20% AHS DMEM 20% AHS 21/6
*./ Nhận xét 8:
Ở mơi trường EMEM mật độ tế bào luơn tăng trong suốt quá trình nuơi và quan sát. Cĩ lẽ liều lượng mơi trường khá phù hợp cho trường hợp nuơi tế bào cấy chuyền. Trong khi đĩ, cũng sử dụng mơi trường này, trong trường hợp nuơi tế bào sơ cấp, thì tế bào phát triển khơng quá 7 - 9 ngày thì đã bị suy thối rồi chết. Mặc dù cũng sử dụng liều lượng mơi trường tương tự. Mơi trường 14/6 15/6 16/6 17/6 18/6 21/6 EMEM 3 9,2 16,4 19,4 36,2 157,8 Mơi trường 14/6 15/6 16/6 17/6 18/6 21/6 AMNIOMAX 2,2 8,6 12 8,2 22 93,6 DMEM 1 2,8 3,4 0,8 3,4 1,4 EMEM 3 9,2 16,4 19,4 36,2 157,8
C. Trên Cùng Mơi Trường: EMEM.
Bảng 11:
Error!
2. So sánh bảng số liệu giửa các mơi trường.
Bảng 12: 3 9.2 16.4 19.4 36.2 157.8 0 50 100 150 200 14/6 15/6 16/6 17/6 18/6 21/6 EMEM 20% AHS EMEM 20% AHS Biểu đồ 9
2.21 3 8.62.89.2 123.4 16.4 8.2 0.8 19.4 22 3.4 36.2 93.6 1.4 157.8 0 20 40 60 80 100 120 140 160 14/6 15/6 16/6 17/6 18/6 21/6
AMNIOMAXTM-C100 20% FBS DMEM 20% AHS EMEM 20%AHS
*./ Nhận xét 9:
(1).AMNOOMAX: Mật độ tế bào tăng theo thời gian đầu nuơi cấy. Chỉ trừ sự kiện ngày 17/6, ngày thứ 5 sau khi cấy chuyền, mật độ tế bào bị giảm đột ngột. Ngay sau đĩ, lập tức thay mơi trường, và quan sát những ngày tiếp theo mật độ tế bào khơng ngừng tăng lên. Chứng tỏ loại mơi trường và liều lượng mơi trường sử dụng cho cấy truyền cũng như nuơi cấy sơ cấp là khá phù hợp, sẽ là khơng đủ nếu mật độ tế bào quá cao ( mọc bám trên 70% diện tích chai cấy), cần lưu ý tới sự đổi màu củamơi trường trong khi quan sát.
(2).DMEM: Mật độ tế bào tăng trong vịng 2 – 3 ngày đầu sau khi thay mơi trường, khi chuyển qua ngày thứ 4 hoặc ngày thứ 5 của kỳhạn thay mơi trường thì tế bào bắt đầu cĩ hiện tượng suy thối. Chứng tỏ liều lượng 5ml DMEM ứng với 5 ngày thay là khơng phù hợp. Cần thiết phải điều chỉnh lại 5 ml mơi trường DMEM trong vịng 2 - 3 ngày thì thay, cĩ lẽ sẽ phù hợp. Tốc độ và mật độ tế bào mọc trên mơi trường DMEM kém xa 2 mơi trường cịn laiï; Cĩ lẽ do dinh dưỡng khơng phù hợp hoặc do nhiều lý do khác mà ta chưa hoặc khơng kiểm sốt được.
(3).EMEM: Mật độ tế bào khơng ngừng tăng theo thời gian đầu nuơi cấy đối với trường hợp EMEM. Mơi trường phù hợp và liều lượng mơi trường sử dụng là phù hợp trong nuơi cấy thứ cấp.
3. Những điểm khác biệt của các loại mơi trường ảnh hưỡng đến kết quả nuơi kết quả nuơi
AMNIOMAX: là loại mơi trường thương mại, dạng dịch lỏng, chuyên sử dụng để nuơi nguyên bào sợi từ nước ối [Phịng di ttuyền học , bệnh viện phụ sản Từ Dũ], cĩ sử dụng chất bổ trợ, huyết thanh (FBS). Mơi trường AMNIOMAX phù hợp cho cả nuơi cấy sơ cấp và nuơi cấy thứ cấp, trên mơi trường này nguyên bào sợi mọc rất tốt.
EMEM: là loại mơi trường thương mại, dạng dịch lỏng, bổ sung huyết thanh (AHS), chỉ phù hợp cho nuơi cấy thứ cấp, tế bào sẽ mọc bám tốt nếu cĩ sự pha trộn thêm một ít AMNIOMAX (tỉ lệ 1:4). EMEM khơng phù hợp cho nuơi cấy sơ cấp, cĩ nhiều lý do để giải thích cho điều này, nhưng cĩ lẽ, chủ yếu do liều lượng mơi trường sử dụng quá ít so với nhu cầu sử dụng của tế bào.
DMEM: là mơi trường thương mại, dạng bột, pha thành mơi trường dạng lỏng, bổ sung huyết thanh (AHS). DMEM khơng phù hợp cho cả nuơi cấy sơ cấp và nuơi cấy thứ cấp, cĩ nhiều lý do để giải thích cho điều này, nhưng cĩ lẽ, chủ yếu do liều lượng mơi trường sử dụng quá ít so với nhu cầu sử dụng của tế bào.
Một điều minh chứng cụ thể cho khảng định: tế bào khơng mọc tốt