7. PHƯƠNG PHÁP CẤY CHUYỀN – TẠO DỊNG, THU NHẬN
7.1.CẤY CHUYỀN TẾ BÀO
1) Đổ bỏ mơi trường cũ trong bình roux cĩ tế bào (vào bercher đựng nước thải).
2) Dùng pipette hút 2ml PBS(-) cho vào roux, lắc nhẹ để rửa sạch tế bào chết và huyết thanh, đổ bỏ PBS(-), lập lại 2 lần.
3) Dùng pipette khác hút 2ml trypsin cho vào bình roux.
4) Để bình roux trên lịng bàn tay, lắc nhẹ qua lại khoảng 50 lần (chú ý khơng để nắp bình roux chạm tay).
5) Đổ bỏ trypsin, cầm bình roux bằng tay phải vổ nhẹ vào lịng bàn tay trái để tế bào tách khỏi vách bình roux.
6) Hút 2ml E’MEM cho vào bình roux, tráng đều lên bề mặt bình roux cĩ tế bào.
7) Hút vào mỗi bình roux mới bình 5ml mơi trường E’MEM.
8) Dùng pipette 1ml gắn vào bĩp cao su (loại nhỏ) hút sục mơi trường phun đều vào bề mặt bình roux cĩ tế bào để huyền phù tế bào.
9) Hút vào mỗi bình roux mới 0,5ml dịch huyền phù tế bào. Lắc nhẹ, ủ ở 37,5oC trong tủ nuơi.
10) Sau 24 giờ, đổ bỏ mơi trường cũ cho vào bình roux 5ml mơi trường mới để loại bỏ trypsin và những tế bào chết.
Lưu ý: một bình roux chứa đầy tế bào cĩ thể cấy chuyền sang 3 hoặc 4 bình roux mới
*./ Kỹ thuật chọn dịng tế bào:
Đây là kỹ thuật dùng để tách riêng một colony tế bào trong một đĩa nuơi cĩ nhiều dạng tế bào khác nhau.
+ Dùng dung dịch trypsin tách rời các tế bào từ đĩa nuơi cấy, tạo thành dịch huyền phù tế bào.
+ Cấy tế bào vào đĩa nuơi cấy cĩ mơi trường mới với mật độ thấp khoảng 1000 tế bào/ml để các tế bào cách xa nhau trong đĩa nuơi. Tuy nhiên mật độ tế bào cĩ thể thay đổi tùy trường hợp cụ thể.
Nuơi ủ tế bào đến khi chúng phát triển thành những colony riêng rẽ.
Chọn một colony tế bào cần tạo dịng. Cơ lập colony này bằng 1 ống kim loại nặng cĩ kích thước phù hợp. Hút bỏ mơi trường trong ống và tách các tế bào từ colony này bằng trypsin và cấy sang một đĩa mơi trường mới. Nếu cần thiết cĩ thể thực hiện bước chọn dịng này vài lần nữa cho đến khi bảo đảm thu được dịng tế bào từ 1 tế bào đầu tiên