Nuơi cấy sơ cấp gồm:
+Nuơi cấy mơ. Tách bằng cơ học.
+Nuơi cấy tế bào rời. Tách bằng bằng hĩa chất.Hĩa chất gồm cĩ: trysine, Collagenase, Papain, Chymotrypsin.
Sơ đồ 2: Phác đồ phác họa về các phương pháp nuơi cấy sơ cấp.[15]
PRIMARY EXPLANTS
PRIMARY EXPLANTS Hình15 : Phơi ở trong túi màng đệm giai đoạn 8 tuần tuổi:(Ax3),
(Bx1).[16] Hình14: Phơi ở trong tai vịi
7. PHƯƠNG PHÁP CẤY TRUYỀN – TẠO DỊNG, THU NHẬN VÀ LƯU TRỮ DỊNG TẾ BÀO MỤC TIÊU.
7.1. Cấy chuyền tế bào
1) Đổ bỏ mơi trường cũ trong bình roux cĩ tế bào (vào bercher đựng nước thải).
2) Dùng pipette hút 2ml PBS(-) cho vào roux, lắc nhẹ để rửa sạch tế bào chết và huyết thanh, đổ bỏ PBS(-), lập lại 2 lần.
3) Dùng pipette khác hút 2ml trypsin cho vào bình roux.
4) Để bình roux trên lịng bàn tay, lắc nhẹ qua lại khoảng 50 lần (chú ý khơng để nắp bình roux chạm tay).
5) Đổ bỏ trypsin, cầm bình roux bằng tay phải vổ nhẹ vào lịng bàn tay trái để tế bào tách khỏi vách bình roux.
6) Hút 2ml E’MEM cho vào bình roux, tráng đều lên bề mặt bình roux cĩ tế bào.
7) Hút vào mỗi bình roux mới bình 5ml mơi trường E’MEM.
8) Dùng pipette 1ml gắn vào bĩp cao su (loại nhỏ) hút sục mơi trường phun đều vào bề mặt bình roux cĩ tế bào để huyền phù tế bào.
9) Hút vào mỗi bình roux mới 0,5ml dịch huyền phù tế bào. Lắc nhẹ, ủ ở 37,5oC trong tủ nuơi.
10) Sau 24 giờ, đổ bỏ mơi trường cũ cho vào bình roux 5ml mơi trường mới để loại bỏ trypsin và những tế bào chết.
Lưu ý: một bình roux chứa đầy tế bào cĩ thể cấy chuyền sang 3 hoặc 4 bình roux mới
*./ Kỹ thuật chọn dịng tế bào:
Đây là kỹ thuật dùng để tách riêng một colony tế bào trong một đĩa nuơi cĩ nhiều dạng tế bào khác nhau.
+ Dùng dung dịch trypsin tách rời các tế bào từ đĩa nuơi cấy, tạo thành dịch huyền phù tế bào.
+ Cấy tế bào vào đĩa nuơi cấy cĩ mơi trường mới với mật độ thấp khoảng 1000 tế bào/ml để các tế bào cách xa nhau trong đĩa nuơi. Tuy nhiên mật độ tế bào cĩ thể thay đổi tùy trường hợp cụ thể.
Nuơi ủ tế bào đến khi chúng phát triển thành những colony riêng rẽ.
Chọn một colony tế bào cần tạo dịng. Cơ lập colony này bằng 1 ống kim loại nặng cĩ kích thước phù hợp. Hút bỏ mơi trường trong ống và tách các tế bào từ colony này bằng trypsin và cấy sang một đĩa mơi trường mới. Nếu cần thiết cĩ thể thực hiện bước chọn dịng này vài lần nữa cho đến khi bảo đảm thu được dịng tế bào từ 1 tế bào đầu tiên
7.2. Tạo Và Thu Nhận Dịng Tế Bào Mục Tiêu Trên Mơi Trường Thạch Bằng Vịng Rings.[15] Bằng Vịng Rings.[15]
Phác đồ:
7.3. Bảo quản tế bào [3]
1) Tách tế bào trong bình roux bằng trypsin (thao tác như trên từ 1 đến 6).
2) Huyền phù tế bào bằng cách hút sục bằng pipette 1ml với bĩp cao su. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3) Hút dịch huyền phù tế bào vào 2 eppendorf mỗi cái 1ml.
4) Li tâm 1000 vịng/phút trong 10 phút ở 4oC. Bỏ dịch nổi.
5) Cho vào mỗi eppendorf 900ml mơi trường, vortex để huyền phù tế bào.
6) Hút dịch huyền phù ở 2 eppendorf cho vào tube bảo quản tế bào 2ml, bổ sung thêm 200ml DMSO, trộn đều bằng pipetman hay vortex.
7) Để tube bảo quản vào hộp xốp bên trong cĩ lĩt bơng gịn, cho vào tủ lạnh -70oC qua đêm (để nhiệt độ tube bảo quản tế bào hạ xuống từ từ khoảng 1oC/ phút).
8) Bảo quản tube tế bào trong Nitơ lỏng.
7.4 Hoạt hĩa tế bào
1) 1) Tube tế bào lấy từ nitơ lỏng được cho vào becher nước ấm 37– 38oC (cĩ pha một ít javel để khử trùng) để giải đơng..
2) Cho 5ml mơi trường E’MEM (10% huyết thanh) vào bình roux.
3) Dùng pipetman 1ml hút trộn đều tế bào trong tube. Hút dịch huyền phù tế bào cho vào bình roux (cĩ mơi trường) từng giọt một, vừa cho vừa lắc để hịa đều tế bào.
4) Ủ ở 36,5oC trong tủ nuơi. Sau 24 giờ, thay mơi trường cũ bằng mơi trường mới để loại bỏ tế bào chết và DMSO.
8. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH NUƠI CẤY. [15] 8.1 Mơi trường và các yếu tố bổ sung 8.1 Mơi trường và các yếu tố bổ sung
Aûnh hưởng của mơi trường bean ngồi lên quá trình nuơi cấy tế bào biểu hiện qua 4 con đường :
1./ Tính tự nhiên của giá thể rất cĩ ý nghĩa trong quá trình nuơi cấy, nơi tế bào sẽ gắn bám và tăng trưởng; giá thể phù hợp tế bào tăng trưởng
mạnh – điều này tạo ra tính đồng nhất trong tăng trưởng, cĩ thể nuơi lớp đơn trên nhiều giá thể khác nhau như: trên đĩa plastic, trên giá thể bán rắn (trong một loại gel, collagen , agar hoặc trong nuơi cấy dịch treo).
2./ Sự cấu thành của các yếu tố lý hố và sinh lý của mơi trường. 3./ Sự thiết lập về giai đoạn pha khí.
4./ Aûnh hưởng của nhiệt độ ủ.
Việc nuơi những tế bào từ những mảnh mơ cĩ thể được cấy chuyền và tăng sinh in vitro dẫn đến việc thử nghiệm tạo ra nhiều mơi trường hơn để duy trì sự tăng trưởng của dịng tế bào liên tục và thay thế mơi trường tự nhiên như : dịch chiết phơi, dịch thuỷ phân protein, lymph v.v.
Sự tiếp cận để phát triển một mơi trường mới bắt đầu với một mơi trường giàu chất dinh dưỡng như : Ham’s F12 [1965] hoặc mơi trường 199 được bổ sung với nồng độ cao của huyết thanh (20%) và dần dần thử nghiệm giảm bớt huyết thanh bởi sự thay đổi nồng độ của các thành phần tồn tại trong mơi trường và thêm vào các yếu tố mới.
8.2 Yếu tố bề măt của chai nuơi - giá thể
Phần lớn tế bào động vật cĩ xương sống cĩ khả năng tăng trưởng thành lớp đơn trên bề mặt nhân tạo trong điều kiện nuơi in vitro. Từ những cố gắng sớm nhất, thủy tinh đã được sử dụng như là giá thể, khởi đầu do đặc tính quang học của nĩ, nhưng do tế bào cần dàn trãi, gắn bám lên trên một bề mặt giá thể thích hợp cho sự tăng trưởng [15] để khắc phục tình trạng này sau đĩ người ta đã dùng nhựa plastic do chúng cĩ đặc tính quang học tốt và bề mặt tăng trưởng bằng phẳng, tạo ra được các đơn vị tăng trưởng tế bào và sự tái tạo trong nuơi cấy.
Hiện nay đa số người ta thích dùng polystyrene. Ngồi ra cịn cĩ các loại giá thể bán thấm, các loại vi giá thể và giá thể nhân tạo khác.
Sự lựa chọn giá thể được quyết định dựa vào: + Khả năng sinh sản của tế bào.
+ Sự tăng của tế bào trong dịch treo hoặc tạo lớp đơn. + Việc nuơi nên để thơng khí hay bịt kín.
+ Mẫu chuẩn và mẫu thí nghiệm được thực hiện hay khơng. + Giá cả cĩ hợp lý.
8.3 Yếu tố vật lý.
8.3 .1. Áp suất thẩm thấu:
Hầu hết tế bào được nuơi cĩ một giới hạn chịu đựng khá rộng về áp suất thẩm thấu. Aùp suất thẩm thấu của huyết tương người là 290mOsm/kg và người ta cho đây là áp suất tối ưu cho những trường hợp nuơi những tế bào người in vitro, mặc dù cĩ sự khác nhau đối với các loại tế bào khác nhau.
Trong thực tế, áp suất thẩm thấu giữa 260 mOsm/kg và 320 mOsm/kg thường được chấp nhận cho hầu hết những tế bào, nhưng nên cĩ một sự chọn lựa và nên giữ ở mức sai số: ± 10 mosm/kg.
8.3 .2. Nhiệt độ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp lên sự tăng trưởng của tế bào vì nĩ làm ảnh hưởng đến pH do sự gia tăng của các CO2 hồ tan ở nhiệt độ thấp và do sự thay đổi về ion và pKa của dung dịch đệm. pH nên được điều chỉnh thấp hơn 0.2 đơn vị ở nhiệt độ phịng hơn là ở 36.50C là điều liện tốt nhất để tạo ra mơi trường hồn tồn với huyết thanh nếu được sử dụng và ủ mẫu qua đêm ở 36.50C.
Nhiệt độ tối ưu cho tế bào nuơi phụ thuộc vào :
+ Nhiệt độ cơ thể của động vật nơi tế bào được thu nhận
+ Tuỳ thuộc vào các vùng khác nhau về nhiệt độ cơ thể ( như
da và tinh hồn cĩ nhiệt độ thấp hơn các vùng khác trong cơ thể ).
+ Nhiệt độ được quan tâm đối với người và dịng tế bào động vật máu nĩngtốt nhất là 36.50C. Gần với nhiệt độ cơ thể nhưng thấp hơn để đảm bảo an tồn, nhiệt độ quá cao ảnh hưởng nghiêm trọng hơn nhiệt độ quá thấp.
+ Tế bào nuơi cĩ thể dừng tăng trưởng dựa vào việc điều khiển nhiệt độ, cĩ thể tồn tại một vài ngày ở 40C và cĩ thể bị đơng lạnh, ngừng hoạt động sinh lý ở nhiệt độ lạnh sâu: –1960C , nhưng khơng thể tồn tại ở nhiệt độ 20C trong điều kiện bình thường khoảng một vài tiếng và chết khá nhanh ở nhiệt độ 400C và cao hơn.
8.3.3 Tính nhớt
Tính nhớt của mơi trường bị ảnh hưởng bởi các thành phần của huyết thanh và trong một số trường hợp, ảnh hưởng một ít lên sự tăng trưởng tế bào. Tính nhớt trở nên đặt biệt quan trọng khi mà nuơi dịch treo được lắc hoặc khi dịch nuơi được khuấy hoặc khi tế bào được tách ra sau khi bị trypsin hố.
8.3 .4 Áp lực sức căng bề mặt và sự tạo bọt.
Aùp lực sức căng bề mặt được sử dụng để kiểm sốt sự bám dính của mảnh mơ được cấy nguyên phát với giá thể. Trong nuơi cấy dịch treo với 5% CO2 trong khơng khí thì bọt được tạo ra trong mơi trường chứa huyết thanh. Sự thêm vào của một Silicone kháng bọt (Dow chemical) hoặc Pluronic F68
(Wyandotte) giúp cải thiện điều này bởi làm giảm áp lực sức căng bề mặt.
Aûnh hưởng của sự tạo bọt chưa được xác định rỏ ràng như là tỉ lệ của sự biến tính protein khi gia tăng và nguy cơ của việc nhiễm gia tăng, nếu sự tạo bọt gia tăng đến cổ của lọ nuơi, tốt nhất là nên tránh.
8.4. Yếu tố hĩa học.
8.4.1 Oxygen
Phần quan trọng trong cấu tạo của pha khí là Oxy và CO2. Aùp lực Oxy phù hợp với hầu hết các loại tế bào nuơi, nuơi cơ quan, đặc biệt là giai đoạn
muộn của phơi, cá thể mới sinh hoặc trưởng thành đều cần đến 95% Oxy trong pha khí.
Chiều sâu của mơi trường cĩ ảnh hưởng đến tỉ lệ khuyếch tán Oxy hồ tan của tế bào, thích hợp nhất nên giữ độ sâu của mơi trường trong khoảng 2-5mm.
8.4.2.. CO2
CO2 cĩ nhiều vai trị quan trọng như : ảnh hưởng đến nồng độ CO2
hồ tan, pH và nồng độ HCO3-. Rất khĩ khăn để xác định chính xác áp lực CO2
khơng khí để kiểm sốt nồng độ CO2 hồ tan.
Đây là một phản ứng thuận nghịch diễn ra:
H2O + CO2 ' H2CO3' H+ + HCO3- (1) Kết quả của việc gia tăng CO2 khơng khí là làm giảm pH. Vì thế, hiệu quả của việc gia tăng áp lực CO2 được trung hồ bởi sự gia nồng độ bicarbonate:
NaHCO3' Na+ + HCO3- (2)
Sự gia tăng HCO3- làm cân bằng (1) cho đến khi cĩ sự cân bằng pH ở 7.4:
NaOH + H2CO3' NaHCO3 + H2O ' Na+ + HCO3- + H2O (3)
Tĩm lại, nuơi tế bào ở nồng độ thấp trong chai mở cần ủ trong CO2
khơng khí nơi mà nĩ đượccân bằng với sodium bicarbonate trong mơi trường. Ở tại nồng độ tế bào rất thấp cần thêm CO2 vào pha khí của bình kín đối với hầu hết việc nuơi. Khi nồng độ tế bào cao, khơng cần thiết để thêm CO2 vào pha khí trong chai kín và cũng khơng cần đối với chai mở.
8.4.3.PH (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hầu hết các dịng tế bào đều tăng trưởng tốt ở pH 7,4. Mặc dù điều kiện thuận lợi về pH đối với sự phát triển của tế bào sẽ thay đổi liên quan đến các kiểu tế bào khác nhau. Dịng nguyên bào sợi bình thường ở Người thích hợp
nhất ở pH: 7,4 – 7,7.
Phenol Red thường được sử dụng như là một chất chỉ thị. Nĩ cĩ màu đoû ở pH 7,4, trở nên hồng ở pH 7,0, màu chanh ở pH 6,5, vàng chanh ở pH dưới 6,5, hơi hồng ở pH 7,6 và tím ở pH 7,8.
8.4.4. Dung dịch đệm
Mơi trường nuơi phải được đệm bởi hai lý do :
+ Đĩa, chai thường xuyên được mở ra, nơi tạo điều kiện cho CO2 xâm nhập và làm cho pH gia tăng.
+ Sự sản sinh quá nhiều CO2 và acid lactic trong dịng tế bào bị biến đổi ở mật độ tế bào cao, khi đĩ pH sẽ giảm xuống. Một loại dung dịch đệm phải được sử dụng để kết hợp chặt chẽ trong mơi trường để giữ pH khơng thay đổi nhưng trong phản ứng (1) sản phẩm CO2 ngoại sinh cĩ lẽ cần cho vài dịng tế bào, đặc biệt ở nồng độ tế bào thấp, việc ngăn chặn tổng lượng CO2 hồ tan mất đi là cần thiết nếu khơng sẽ khiến Bicarbonate trong mơi trường bị thất thốt.
Dung dịch đệm Bicarbonate được sử dụng thường xuyên hơn các dung dịch đệm khác do chúng cĩ khả năng đệm ở mức thấp hơn pH sinh lý, tạo ra ít độc tố, giá thành thấp và giá trị kinh tế cho việc nuơi cấy tế bào.
HEPES là một loại dung dịch đệm mạnh, cĩ khả năng đệm ở pH khoảng 7.2 – 7.6 và được sử dụng ở 10 hoặc 20 mM. Khi HEPES được sử dụng với CO2 ngoại sinh, khi đĩ nồng độ của dung dịch HEPES cần được dùng với lượng nhiều hơn hoặc gấp đơi của lượng Bicarbonate tương ứng.
8.5. Mơi trường tủ nuơi.
Cần hạn chế mở cửa tủ cấy ra nhất là trong trường hợp phịng vơ trùng thí nghiệm khơng đạt chuẩn yêu cầu.
Tránh chồng các đĩa, chai cấy tủ cấy, dễ ngã đổ mơi trường lên nắp trong miệng chai cấy, nếu khơng cĩ thể làm tăng nguy cơ nhiểm và gây nhiểm cả mơi trường bean trong tủ cấy.
Tránh sự rung lắc, dao động tủ cấy làm ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.
Nhiệt độ tủ cấy nên ổn định khơng đổi trong khoảng: 36,5 (+/- 0,5oC).
9. TỈ LỆ MƠI TRƯỜNG VỚI MẬT ĐỘ TẾ BÀO ĐEM NUƠI, LƯỢNG MƠ ĐEM CẤY .[15] ĐEM CẤY .[15]
Đối với cách tế bào bằng trypsin, người ta thường sử dụng: 5ml mơi trường/chai cấy loại 25cm2, và mật độ tế bào từ 106 đến 107 tế bào/ml.
+ Với mơi trường giàu dinh dưỡng cĩ bổ xung sẳn chất bổ trợ như:
AMNIOMAXTM-C100 20% FBS thì thường sử dụng 1ml ứng với 1ngày sau thay, 5ml ứng với 5 ngày thay.
+ Với mơi trường nghèo dinh dưỡng như: DMEM 20% AHS,
EMEM 20% AHS thì thường sử dụng 5 ml ứng với 2 ngày sau thay.
Đối với cách tách bằng cơ học, nuơi cấy nguyên phát, người ta thường sử dụng cách thay và liều lượng thay mơi trường như sau :
+ 1ml mt /1 chai cấy (1 ngày thay) ứng với chai cấy loại 25cm2. + 2ml mt/1 chai cấy (2 ngày thay) ứng với chai cấy loại 25cm2. + 3ml mt/1 chai cấy (3 ngày thay) ứng với chai cấy loại 25cm2. + 5ml mt/1 chai cấy (5 ngày thay) ứng với chai cấy loại 25cm2.
10. MƠI TRƯỜNG NUƠI CẤY [3] 10.1. Mơi trường 10.1. Mơi trường
Thành phần mơi trường nuơi cấy tế bào động vật phức tạp hơn rất nhiều so với mơi trường nuơi cấy vi sinh vật và tế bào thực vật. Trong các cơng trình đầu tiên về nuơi cấy tế bào động vật người ta dùng hỗn hợp dung dịch
muối sinh lý, huyết thanh và chiết phẩm phơi gà làm mơi trường nuơi cấy. Do thành phần huyết thanh và chiết phẩm phơi gà rất rất phức tạp, khĩ ổn định nên người ta dần dần quan tâm đến việc nghiên cứu chế tạo các mơi trường tổng hợp để cĩ thể chủ động bảo quản, sử dụng, điều chỉnh thành phần mơi trường và ổn định mơi trường trong những lần nuơi cấy khác nhau.
Hiện nay, trừ những dịng tế bào đã thiết lập được thuần hĩa với mơi trường tổng hợp hồn tồn, đa số các dịng tế bào được nuơi cấy trong mơi