n i: Số đĩa có khuẩ lạc được chọ fi: Độ pha loãg tươg ứg
3.3Phương pháp PCR
Tất cả các chủng C.botulinum được nuôi cấy trong 10 ml Tryptose- Peptone-glucose- Yeast extract (TPGY) và ủ trong điều kiện kỵ khí ở 37°C trong 24-48h, tiếp theo nuôi qua đêm (20 giờ ở nhiệt độ tương ứng).
Bước1. Chuẩn bị khuôn mẫu: Lấy 1 ml dung dịch chứa tế bào từ môi
trường, rửa sạch với 1 ml đệm TE (0,01 M Tris-HCl, EDTA 0,001 M ,PH 8.0) trong 1 giờ ở 37°C và ngâm trong 1 ml nước cất. Ngoài các tế bào riêng rẻ được phân lập của từng chủng vi khuẩn, ba hỗn hợp được phân lập chứa các
C.botulinum thủy phân protein loại A, B và F, các C.botulinum không thủy phân
protein loại B, E , và F hoặc tất cả bốn huyết thanh đã được chuẩn bị bằng cách trộn riêng rẻ các tế bào được phân lập. Mọi các tế bào phân lập được đun nóng ở 990 C trong 10 phút để chia tế bào và phát hành các DNA của vi khuẩn và đã ly tâm trong 5 phút ở 10.000 × g. Một khối lượng của 1μl của nổi trên mặt từng được sử dụng như bản mẫu trong hỗn hợp PCR. Tất cả được đun nóng ở 990C trong 10 phút nhằm phá vỡ tế bào và tách chiết DNA của C.botulinum. Ly tâm trong 5 phút ở 10.000 vòng/phút. Khoảng 1 μl dịch nổi trên mặt được sử dụng như bản mẫu trong hỗn hợp PCR.
Bước2. Mồi: Dựa trên công bố trình tự DNA của gen BoNT, bốn cặp mồi mới với nhau được cụ thể cho cả hai loại C. botulinum A, B, E, hoặc F được thiết kế ( Bảng 2)
Bảng 3.2: Mồi bắt cặp của C.botulinum
Bảng 2: Mồi cho multiplex PCR của C.otulinum loại A, B, E và F
Loại Mồi Chuỗi (5’ – 3’) Produrct Vị trí trên gen Nhiệt Độ GC
Size (bp) (mã vùng) ( 0C) (%)
Af CBMLA1 AGC TAC GGA GGC 782 1788-1808
63.9 52
AGC TAT GTT
Ar BMLA2 CGT ATT TGG AAA 2569-2548 63.4 41
GCT GAA AAG G
Bf CBMLB1 CAG GAG AAG TGG 205 434-453
64.3 50
AGC GAA AA
Br CBMLB2 CTT GCG CCT TTG 638-619 64.5 45
TTT TCT TG
Ef CBMLE1 CCA AGA TTT TCA 389 156-175 63.7 45 TCC GCC TA
Er CBMLE2 GCT ATT GAT CCA 544-525 63.6 43
AAA CGG TGA
Ff CBMLF1 CGG CTT CAT TAG 543 185-194 64.1 50 AGA ACG GA
Fr CBMLF2 TAA CTC CCC TAG 727-708 63.3 55
Bước 3. PCR: PCR được thực hiện với 50 μl của hỗn hợp phản ứng có
chứa 1μl của mẫu, 0,3 μM của mỗi mồi, 220 nM của mỗi triphosphate deoxynucleotide (dATP, dCTP, dGTP, và dTTP), 32 mM Tris-HCl (pH 8,4), 80 mM KCl, 4,8 mM MgCl, và DNA polymerase. Các sản phẩm PCR khuyếch đại được xác định ở agarose gel 2% nhuộm màu với ethydium bromide.
Bước 4. Đọc kết quả:
Multiplex PCR của tế bào C.botulinum loại A, B, E, và F mang lại những sản phẩm khuếch đại dự kiến (Bảng 3.2): loại A: 782 bp; loại B: 205 bp; loại E: 389 bp; và loại F 543 bp (Hình 3.3). Hỗn hợp bị đình các tế bào mang các đoạn DNA tương ứng. Các sản phẩm PCR được hình dung rõ ràng trong gel agarose, từ 150bp đến 200bp khác biệt trong kích thước của mỗi sản phẩm khuếch đại kích hoạt một sự phân biệt giữa các mảnh vỡ dễ dàng mà không cần sử dụng độ phân giải cao agarose.
Multiplex PCR phát hiện của C. botulinum. Đường 1: trọng lượng phân tử đánh dấu; 2: C. botulinum loại A; 3: C. botulinum loại B; 4: C. botulinum loại E; 5: C. botulinum loại F; 6: C. botulinum thủy phân protein loại A, B và F; 7: C.
botulinum không thủy phân protein loại B, E và F; 8: C. botulinum loại A, B, E, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});