3.1. Phương pháp truyền thống để xác định C.botulinum [6]
3.1.1. Thiết bị và vật liệu
- Tủ lạnh
- Giấy thấm khô - Đèn cồn
- Dụng cụ vô trùng - Cối và chày vô trùng - Kẹp ghép vô trùng
- Pipet có nút và bông gòn vô khuẩu - Dụng cụ phân phối chất lỏng
- Ống nghiệm vô trùng ( một số cần có nút bần) - Bình ủ yếm khí
- Que cấy chuyền
- Tủ ấm, 35± 10C và 26 ±10C
- Bình vô khuẩn bảo quản mẫu dự trữ - Giá đựng ống nghiệm
- Kính hiển vi nền sáng hay đối đa - Đĩa petri vô trùng 15 x 100 mm - Ống ly tâm
- Máy ly tâm lạnh tốc độ cao
- Ống tiêm vô trùng, 1 hoặc 3ml, với kích cỡ 25cm, 1cm, 6cm để tim vào chuột.
- Chuột (khoảng 15-20g)
- Chuồng nhốt chuột, thức ăn cho chuột
3.1.2 Môi trường, dụng cụ, hóa chất
- Pepton đệm bufer pepton water (BPW) - Iron suphide Agar (ISA)
- Perfringns selective Agar ( shahidi ferguson ferfringens, SFP) - Môi trường dịch thể gan băm hay môi trường thịt chín
- Môi trường dịch thể TPGY hay với trypsin ( TPGYT)
- Môi trường thạch – lòng đỏ trứng – gan – thịt bê hay thạch – lòng đỏ trứng yếm khí.
- Dung dịch cồn – odine (iodine 4% trong cồn 70%) - Đệm gen – phosphate vô trùng, pH = 6.2
- Dung dịch nước muối vô trùng - Dung dịch NaOH 1N
- Dung dịch HCl 1N - Cồn tuyệt đối
- Dung dịch trypsin (Difco, 1:250)
- Thuốc nhuộm gam, tím kết tinh, hay xanh methylene
3.1.3. Quy trình phân tích
3.1.3.1. Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích
Mẫu được giải đông ở nhiệt độ không quá 450C và được phân tích ngay sau khi giải đông. Cân 10g (hoặc 25g) mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 90ml (hoặc 225ml) nước pepton đệm và đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Mẫu được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân tùy mật độ hiện diện của C.botulinum trong máu. Trước khi cấy, mẫu được xử lý nhiệt ở 70 – 800C trong 20 phút để diệt bớt tế bào sinh dưỡng của các vi sinh vật khác.
Cấy vào đĩa 1ml dịch mẫu đã được pha loãng thích hợp vào một đĩa petri vô trùng. Đỗ 15ml môi trường ISA hoặc SFP Agar đã được ủ ấm ở 450C vào đĩa, lắc đều. sau khi môi trường đã đông, đỗ lên trên thêm bề mặt khoảng 10ml ISA hoặc SFP Agar. Một phương pháp khác là cho thêm một ống nghiệm vô trùng
1ml dịch mẫu ở nồng độ thích hợp, thêm 12ml ISA hoặc SFP Agar đã ủ ấm ở 450C vào ống trộn đều mẫu. sau khi môi trường đã đông, đỗ thêm lên thêm bề mặt 2-3 ISA hoặc SFP Agar. Đĩa hoăc ống nghiệm đã được cấy mẫu ủ ở 370C trong 24 – 48h trong các bình kỵ khí. Nếu nghi ngờ Clostridium chịu nhiệt thực
hiện ủ song song ở 370C và 500C thông thường đọc kết quả trên đĩa là dễ hơn trong ống nghiệm.
ISA môi trường không chọn lọc nên các loài sinh H2S khác không phải
C.botulinum cũng tăng trưởng được và tạo khuẩn lạc màu đen trên môi trường
này. Để khẳng định khuẩn lạc là C.botulinum cần thực hiện những quy trình tiêu chuẩn để giúp khẳng định kết quả. Phương pháp này chỉ phân lập Clostridium với các vi sinh vật khác, không phân biệt được các loài Clostridium với nhau
như: C.acetobutylicum, C.aerotolerans, C.beijerinckii,
C.bifermentans, C.butyricum,…
đ
Trang 40
Đồng nhất và pha loãng mẫu theo dãy thập phân xử lý mẫu ở 800C trong 15 – 20 phút
Cấy 1ml dung dịch mẫu vào đĩa petri, đổ 10 – 15 ml môi trường ISA ở 450C
lắc đều
Cấy 1ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm vô trùng đổ 10 – 15 ml môi
Hình 3.1 Quy trình phân tích C.botulinum
Cần phải thực hiên các kiểm tra hóa sinh khác mới khẳng định được. Tính chất của các chủng: Bảng 3.1 : Tính chất của các chủng Nhóm I II II IV Dạng độc tố A,B,F B,E,F C,D G Đổ lớp ISA thứ 2 khi lớp thứ nhất đã đông đặc
Đổ lớp ISA thứ 2 cao hơn 1-2cm sau khi lớp thứ nhất đã đông đặc Ủ trong bình kín, ở 370C 24 – 48h Ủ trong bình kín, ở 370C 24 – 48h
Đếm tấc cả các khuẩn lạc màu đen đường kính ≥ 0,5 mm
Đếm tấc cả các khuẩn lạc màu đen xuất hiện trong ống nghiệm
Tính kết quả
Công thức tính:
CFU(ml) = (N*R) / (n1.v.f1 +…+ ni.v.fi ) N: Tổng số khuẩn lạc đếm được R: Tỷ lệ xác xuất
V:Thể tích cấy vào mỗi đĩa