n i: Số đĩa có khuẩ lạc được chọ fi: Độ pha loãg tươg ứg
3.1.4. Phương pháp sử dụng môi trườngTrypticase Peptone Glucose Yeast Extract với Trypsin (TPGYT)
Yeast Extract với Trypsin (TPGYT)
3.1.4.1. Chuẩn bị mẫu
Mẫu được giữ lạnh cho đến khi kiểm tra, trừ các loại thực phẩm đóng hộp còn nguyên. Đánh số thứ tự mẫu.
Đối với thực phẩm rắn và lỏng, cho vào cối vô trùng, thêm một lượng dung dịch đệm gen – phosphate rồi nghiền bằng chày vô trùng. Hay có thể gắp
từng mẫu nhỏ thực phẩm cho vào môi trường trăng sinh nhờ cặp ghép vô trùng. Cấy trực tiếp thực phẩm lỏng vào môi trường nuôi cấy bằng pipet. Chuẩn bị các mẫu dự trữ: sau khi nuôi cấy, chuyển từng phần mẫu dự trữ vào bình dựng mẫu dự trữ và bình dựng mẫu vô trùng để sử dụng các test khi cần thiết.
3.1.4.2. Phát hiện tế bào vi khuẩn
Tăng sinh:
- Loại bỏ oxy hoàn toàn trong môi trường tăng sinh bằng hơi nước trong 10 – 15 phút và làm lạnh nhanh nhưng không cấy trước khi cấy vào mẫu.
- Cấy vào hai ống nghiệm chứa môi trường thịt chín 1-2g thực phẩm rắn hay 1-2ml thực phẩm lỏng ( cho 15ml môi trường tăng sinh). Ủ ở 350C.
- Cấy vào hai ông nghiệm chứa môi trường TPGY theo như trên. Ủ ở 260C . Chỉ sử dụng TPGYT thay thế vi khuẩn được nghi ngờ là chuẩn không phân hủy protein chứa các kháng nguyên B, E hay F. - Lưu ý: phải cho mẫu thực phẩm chìm vào bên dưới bề mặt môi
trường một cách nhẹ nhàng. Sau 5 ngày ủ, kiểm tra canh trường vi khuẩn, kiểm tra độ đục của môi trường, sự tạo khí, hay sự phân hủy cơ chất của thịt. Lưu ý mùi tạo thành, kiểm tra canh trường vi khuẩn dưới kinh hiển vi bằng cách chuẩn bị và quan sát giọt ép dưới kính hiển vi đối pha có độ phân giải cao, hay chuẩn bị vết bôi dịch chứa vi khuẩn nhuộm Gram hay nhuộm đơn với tím kết tinh hay xanh methylene dưới kính hiển vi nền sáng. Kiểm tra hình thái vi khuẩn và lưu ý tế bào điễn hình của C.botulinum số lượng tìm thấy, mức độ bào tử hóa và vị trí của bào tử trong tế bào. Cũng thời điểm này, kiểm tra vi khuẩn về khả năng tạo toxin theo như cách đã mô tả.
Thông thường, toxin được tạo ra với nồng độ lớn nhất sau 7 ngày ủ, ủ thêm 10 ngày nữa để phát hiện ra các bào tử tổn thương do chậm phát triển thành tế bào dinh dưỡng trước khi hấp hơi nước ở áp suất cao để loại bỏ môi trường này. Để phân lập giống thuần, bảo quan canh trường vi khuẩn tại thời điểm tạo nhiều bào tử nhất ở điều kiện 40C.
Phân lập giông thuần
- Có thể phân lập nhanh các vi khuẩn C.botulinum từ hệ vi sinh vật hỗn hợp trong môi trường tăng sinh hay từ mẫu thực phẩm ban đầu nếu quá trình tạo bào tử xảy ra tốt.
- Tiền xử lý mẫu để cấy ria: thêm vào ống nghiệm vô trùng có nút
bần chứa 1-2ml canh trường vi khuẩn một thể tích tương ứng cồn tuyệt đối đã được lọc vô trùng, lắc đều và ủ nhiệt trong phòng trong 1 giờ. Để phân lập vi khuẩn, lấy 1-2ml mẫu đã dự trữ cho vào ống nghiệm có nút bần, thêm một thể tích tương ứng cồn tuyệt đối đã lọc vô trùng, lắc đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1giờ. Hay cách khác, có thể đun 1 hay 2ml môi trường tăng sinh có chứa vi khuẩn ở 800C trong 10-15 phút để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng. Không xử lý nhiệt với các vi khuẩn C.botulinum không phân hủy protein.
- Cấy mẫu đã xử lý: sử dụng que cấy vòng cấy 1 hay 2 vòng dây cấy
chứa đầy dịch mẫu đã xử lý theo một trong 2 phong cách trên lên môi trường thạch - lòng đỏ trứng - gan thịt bê hay thạch – lòng đỏ trứng yếm khí để tách khuẩn lạc phát triển riêng lẻ. Nếu cần thiết, pha loãng mẫu đến mức có thể cho các khuẩn phát triển dính nhau sau khi ủ. Ủ các đĩa khô trước khi đem ủ nhằm tránh vi khuẩn phát
triển dính nhau sau khi ủ. Ủ các đĩa ở 350C trong 48 giờ trong điều kiện yếm khí.
Chọn khuẩn lạc vi khuẩn C.botulinum điển hình
- Chọn: chọn lấy mẫu 10 khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn C.botulinum phát triển độc lập. Những khuẩn lạc này có đặc điểm
gồ cao hay dẹt, nhẵn hay xù xì. Chúng thường phát triển và phân bố dàn trải và có mép không đều. Trên môi trường lòng đỏ trứng, chúng có bề mặt óng ánh khi kiểm tra dưới ánh sáng chiếu lệch góc. Những vùng óng ánh này trông giống như lớp ngọc trai, theo trước và sau đường viền không điều của khuẩn lạc. Bên cạnh vùng ngọc trai khuẩn lạc C.botulinum loại C, D và E thường được bao quanh bởi một vùng kết tủa rộng (2-4mm), màu vàng. Các khuẩn lạc loại A và B thường có vùng kết tủa nhỏ hơn. Việc phân lập các khuẩn lạc có tính tương đối khó khăn bởi vì một số thành viên nhất định của giống Clostridium cũng do khuẩn lạc có hình thái tương tự nhưng không sinh độc tố.
- Cấy khuẩn lạc vào môi trường dịch thể: sử dụng que cấy vòng để
cấy khuẩn lạc C.botulinum loại E vào môi trường TPGY , các khuẩn lạc sinh ra các toxin khác vào môi trường gan băm hay môi trường thịt chín. Sau đó đem ủ trong 5 ngày, kiểm tra sự tạo thành toxin. - Phân lập giống thuần: cấy ria lại các chủng loại toxin lên môi
trường thạch lòng đỏ trứng. Ủ một đĩa ở 350C trong điều kiện yếm khí, còn đĩa kia ủ ở 350C trong điều kiện hiếu khí. Nếu khuẩn lạc điển hình của C.botulinum phát triển trên đĩa thạch đã ủ yếm khí và không phát triển trên đĩa ủ hiếu khí thì giống có thể đã thuần. Nếu không phân lập được C.botulinum từ ít nhất một trong các khuẩn lạc
đã chọn có nghĩa là mật độ phân bố của chúng trong hệ vi sinh vật hỗn hợp có thể thấp. Tiếp tục cấy chuyền liên tiếp vào môi trường tăng sinh có thể làm tăng số lượng của chúng lên đủ để cho phép phân loại được. Bảo vệ giống thuần ở trạng thái bào tử trong tủ lạnh, trên các hạt thủy tinh, đông lạnh hay đông khô.
3.1.4.3 . Phát hiện độc tố botulin
Chuẩn bị mẫu : lấy 1 phần mẫu để phát hiện tế bào vi khuẩn C.botulinum
sống, 1 phần khác để kiểm tra độc tính. Bảo quản phần mẫu còn lại trong tủ lạnh. Ly tâm các mẫu chứa chất rắn lơ lửng trong điều kiện lạnh và sử dụng phần lỏng để phân tích độc tính. Chiết mẫu thực phẩm rắn với 1 thể tích tương ứng của dung dịch đệm gel-phosphate, pH= 6,2. Tẩm ướt chất đệm vào mẫu thực phẩm bằng cối và chày đã làm sạch. Ly tâm mẩu đã giã trong điều kiện lạnh và sử dụng phần lỏng để phân tích độc tính. Rửa sạch các dụng cụ chứa mẫu nghi có dính thực phẩm với vài ml dung dịch đệm càng tốt để tránh pha loãng toxin đến mức không thể phát hiện được.
Xác định độc tính của mẫu thực phẩm hay canh trường vi khuẩn
- Xử lý với trypin : nếu có mặt các độc tố của các vi khuẩn không
phân hủy protein trong mẫu thì cần phải kích hoạt bằng trypin để xác định. Vì vậy, cần xử lý phần lỏng của mẫu rắn sau khi ly tâm, hay mẫu lỏng, hay dịch môi trường thịt chín chúng vi khuẩn với trypin trước khi phát hiện độc tính. Không xử lý trypin với môi trường TPGY, bởi vì môi trường này đã chứa sẵn trypin và nếu xử lý tiếp với trypin có thể làm giảm hoạt tính của các toxin đã được kích hoạt ở mức cao nhờ trypin có sẵn trong môi trường. Điều chỉnh pH của phần mẫu lỏng về 6,2 với dung dịch NAOH 1N hay HCl
1N. Thêm 0,2ml dung dịch trypin bão hòa trong nước vào 1,8ml mỗi phần mẫu lỏng. Ủ dịch hỗn hợp này ở 35-370C trong 1 giờ, thỉnh thoảng trộn đều, để kiểm tra độc tính. Để chuẩn bị dung dịch trypin, cho 1gam trypin (Difco, 1:250) vào một ống nghiệm sạch và thêm 10ml nước cất, lắc và hơ nóng nhẹ để hòa tan.
- Kiểm tra độc tính: tiến hành các test song song trên các mẫu đã xử
lý và không xử lý với trypin (lặp đôi). Pha loãng 1 phần của mẫu lỏng hay canh trường vi khuẩn chưa xử lý đến 1:2 , 1:10 và 1:100 , trong dung dich đệm gel-phosphate. Tiến hành pha loãng tương tự với từng mẫu loãng hay canh trường vi khuẩn đã được xử lý với trypin. Tiêm vào bụng mỗi con chuột, theo từng cặp chuột, 0,5ml mẫu lỏng chưa pha loãng vào 0,5ml mẫu kiểm tra chưa xử lý ở mỗi độ pha loãng bằng cách sử dụng ống tiêm 1 hay 3ml với kim cỡ 25cm, 1,6cm. Lặp lại các bước này với các mẫu đã xử lý với trypin (lặp đôi). Đun 1,5ml mẫu lỏng hay canh trường vi khuẩn trong 10phút ở 1000C. Làm lạnh rồi tiêm 0,5 (chưa pha loãng) vào từng con chuột theo từng cặp. Chuột sẽ không chết, bởi vì độc tố botulin nếu có sẽ bị bất hoạt bởi nhiệt.
- Quan sát tất cả các con chuột theo từng khoảng thời gian nhất định trong 48giờ. Ghi nhận triệu chứng và thời gian chuột chết. Triệu chứng ngộ độc ở chuột bắt đầu thường trong 24 giờ đầu tiên, lông xù lên, thở mạnh từng hồi, cơ thể yếu dần, cuối cùng là liệt và hơi thở yếu hẳn rồi chết. Nếu chuột chết mà không có các triệu chứng ở trên thì không có đủ bằng chứng để kết luận rằng độc tố botulin có trong chất lỏng tiêm vào chuột. Đôi khi chuột chết là do các hợp chất độc có trong mẫu tiêm hay nhiễm trùng do vết thương.