n i: Số đĩa có khuẩ lạc được chọ fi: Độ pha loãg tươg ứg
3.2.1.Phương pháp Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
3.2.1.1. Khái niệm
Được sử dụng để phát hiện độc tố hoạt tính sinh học và sự dò tìm độc tố không tích cực. Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch là phản ứng kết hợp giữa một tế bào (kháng nguyên) với một kháng thể đặc hiệu. Tín hiệu của phản ứng miễn dịch có thể nhận biết thông qua sự ngưng tủa hay kết dính của kháng nguyên - kháng thể hoặc bằng cách sử dụng những kháng thể đã được đánh đấu (bằng chất nhuộm huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzym).
Phương pháp này có thể sử dụng cho hầu hết tất cả kháng nguyên với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Nguyên tắc của kỹ thật ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài những đĩa giếng, nếu có sự hiện điện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ giữ lại trên bề mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzym như horseradish peroxydase hay alkaline phosphatese. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu của enzyem vào giếng, enzyme xúc tác thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng. Bằng cách theo dõi sự đổi màu có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên.
3.2.1.2. Quy trình thực hiện
Nguyên vật liệu cơ bản
- Máy đọc ELISA có bước sóng 405nm
- Bản nhựa 96 giếng đáy phẳng (của hãng NUNC, Denmark) - Pipetman loại 20, 200, 1000 microlit và đầu typ tương ứng
- Dung dịch TYG: Môi trường dịch thể Trypticase (Tryptic) – Pepton-Glucose-Yeast Extrace với Trypsin ( TPGYT).
- Hòa tan các thành phần rắn của môi trường cơ bản và cho vào ống nghiệm 20x150mm từng thể tích 15ml hay cho 100ml vào các lọ dung tích 170ml có vạch chia. Hấp tiệc trùng các ống nghiệm ở 1210C trong 10 phút và các lọ trong 15 phút ở 1210C pH=7. Bảo quản ở 50C. Thêm Tripsin nagy khi sử dụng
- Mẫu C.botulinum.
- Mẫu chứa huyết thanh thỏ có kháng thể TgG
- Dung dịch đệm Bicabonate 0.05 M, 0.8g Na2CO3 + 1.47g NaHCO3
trong 500ml nước cất ở pH =9.6 - 1% dung dịch đệm casein
- Đệm NaCl 0.005%, tween 20 6.04g Trisbazo; 8,76g NaCl, thêm 900ml nước cất phân hủy Tris và NaCl, điều chỉnh pH = 250C với HCl 2M và 50ml dung dịch tween 20 và định mức tới vạch 1 lít. - Dung dịch đừng phản ứng H2SO4 0,3M pha loãng.
Các bước tiến hành ELISA
Chuẩn bị hỗn hợp dịch vi khuẩn
- Nuôi cấy mẫu bệnh phẩm trên môi trường TPGY Hoặc CMM ở 370C. Sau 24h sinh trưởng ở 370C, 5ml môi trường được cho vào môi trường thẩm tích bao gồm: 2.5 lít Peptone Protease 4%, 1% chiết nấm men, 1% dextrone.
- Điều chỉnh pH trung bình đến 7.3 trước khi khử trùng. - Môi trường được ủ ở nhiệt độ phòng 10 ngày.
- Môi trường nổi trên mặt được ly tâm 18000 vòng trong 20 phút. - Chất lỏng nổi lên trên bề mặt được tách riêng và đem đi đông lạnh
với thể tích như nhau của glycerol.
Kỹ thuật ELISA xác định kháng thể đặc hiệu kháng Clostridium chất
dịch của mẫu
Y Chuẩn bị mẫu đối chứng
- Mẫu âm tính: bản sao giống với tấc cả các thuốc trừ độc ( không pha loãng vô trùng CMM & TPGY)
- Mẫu dương tính kiểm tra độc tố chuẩn loại A, B, E, F pha loãng vô trùng CMM & TPGY (pH=7.6 ở nồng độ 2µg/ml).
Y Chuẩn bị mẫu toxin ở dạng thô hoặc lọc sạch
- Bước 1(gắn bảng nhựa): cho mẫu chứa kháng thể IgG để kết hợp
với kháng nguyên ở mẫu pha loãng 1:500 trong dung dịch đệm carbonate, pH=9.6. Cho 100µl/giếng, ủ qua đêm ở 40C. Rửa 3 lần bằng dung dịch PBS-Tween 20 0.05%.
- Bước 2 ( gắn kháng nguyên): Cho 300µl mẫu chứa kháng nguyên 9 với nồng độ 109 tế bào/ml) hoặc ở dạng siêu nghiền đã pha loãng ở nồng độ 10µg/1ml trong dung dịch đệm PBST vào mỗi giếng của bảng, ủ 60-90 phút ở 350C. Sau đó rửa bảng với dung dịch rửa PBS- Tween 0.05% (3-5) lần.
- Bước 3: Phủ bảng nhựa bằng dung dịch PBS-sữa không béo 5%
PBS-Tween 20 0.05%. cho 300µl/giếng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Bước 4: Đem ủ mẫu chứa độc tố 2h, 350C. Rửa mẫu trên 5 lần trong PBST.
- Bước 5: Thêm 100µl/giếng biotin để pha loãng chứa kháng thể có gắn nhãn peroxidase, ủ 60 phút, trong 350C.
- Bước 6: Rửa mẫu trên với PBST loại bỏ các phần không liên kết.
- Bước 7: Cho 100µl cơ chất TMB vào mỗi giếng, ủ trong tủ ấm 370C trong 15-30 phút, không rửa.
- Bước 8: Phản ứng có thể dừng lại nếu cho vào H2SO4 0.3M.
Y Đọc kết quả:
- Đọc bằng mắt thường nhờ bảng so màu
- Đọc bằng máy ELISA: Đọc kết quả ở bước sóng 405nm và ghi nhận kết quả:
Kết quả thử nghiệm xem như dương tính nếu tỷ lệ mật độ quang (OD) của thử nghiệm và chứng âm là >2.3
Ngưỡng phản ứng = 2.3 x OD chứng âm
OD mẫu < OD ngưỡng: Âm tính
Chú ý: Giá trị OD của hai giếng trên cùng một mẫu lệch nhau gấp đôi thì
cần xét nghiệm lại mẫu đó.