ở 370C. Sau đó lần lượt cho qua 3 cốc paraffin ở nhiệt độ 560C mỗi cốc 4 - 6 giờ.
(Khi tẩm cần theo dõi nhiệt độ liên tục, nếu nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp miếng tổ chức sẽ bị hỏng).
- Đổ Block: Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ, khuôn giấy, paraffin phải nóng chảy hoàn toàn nhưng nhiệt độ không đợc quá cao sẽ ảnh hởng đến chất lượng tiêu bản sau này. Đợi cho paraffin đông đặc hoàn toàn, bóc bỏ khuôn giấy và sửa lại Block cho vuông vắn.
- Cắt dán mảnh: Cắt miếng tổ chức trên máy cắt Microtom với độ dày 3 μm. Mảnh tổ chức khi được cắt ra sẽ được để tãi phẳng nhờ nước trứng trên ngọn lửa đèn cồn. Để miếng tổ chức khô nhờ không khí sau một thời gian thì cho vào tủ ấm 370.
- Nhuộm tiêu bản: Dùng thuốc nhuộm Hematoxylin - nhuộm bào t- ương
Dung dịch I: Hematoxylin: 1 gam Cồn 950: 10ml Dung dịch II: Phèn Kali: 20 gam
Nước cất: 200ml
Trộn dung dịch I và II vào một bình, đun sôi trên ngọn lửa nhỏ, vừa đun vừa khuấy cho đến khi sôi cho thêm 3 ml dung dịch KMnO4 bão hoà, sau đó để nguội và lọc. Cho hỗn hợp lọc đợc vào lọ thuỷ tinh nút mài dùng dần.
Thuốc nhuộm Eosin dùng để nhuộm nguyên sinh chất của tế bào. Cách pha: Eosin: 1 gam, cồn 960: 250 ml
Hoà tan, lọc kỹ có thể cho thêm vào vài giọt axit axetic.
Các bước nhuộm tiêu bản:
+ Tẩy Paraffin: Cho tiêu bản lần lượt qua 3 lọ Xylen mỗi lọ 3 - 5 phút. Khi cho tiêu bản qua Xylen phải thường xuyên nhấc lên nhấc xuống cho tan paraffin, dùng khăn lau sạch paraffin xung quanh miếng tổ chức.
+ Tẩy Xylen: dùng cồn Ethylic: Cốc 1: 960 từ 3 - 5 phút. Cốc 2, 3: 1000 từ 3 - 5 phút.
+ Nhuộm Hematoxilin: Ngâm tiêu bản trong dung dịch Hematoxilin khoảng 5 - 10 phút tùy theo chất lượng thuốc nhuộm và độ dầy tiêu bản. Sau khi nhuộm Hematoxylin phải kiểm tra, nếu màu tiêu bản nhạt có thể nhúng nhanh tiêu bản qua NaHCO3 1% để tiêu bản đậm hơn.
Cách pha dung dịch NaHCO3 1%: NaHCO3 1 gam, nước cất 100 ml Nếu tiêu bản đậm quá có thể nhúng nhanh qua cồn Axit chlohydric. Sau khi điều chỉnh màu rửa sạch tiêu bản bằng nước cất.
+ Nhuộm Eosin: Cho tiêu bản vào Eosin khoảng 30 giây - 2 phút tùy theo thực tế, nếu màu Eosin nhạt có thể cho vào dung dịch Eosin 1 - 2 giọt Axit axetic. Sau đó rửa bằng nước cất 1 - 2 phút.
+ Tẩy nước: dùng cồn Ethylic tẩy nước trong tiêu bản. Cồn 900 cốc 1: 2 - 3 phút. Cồn 1000 cốc 2, 3: 3 - 5 phút
+ Làm trong: Cho tiêu bản qua 2 cốc Xylen mỗi cốc 3 - 5 phút + Gắn lamen, dán nhãn và đọc kết quả trên kính hiển vi.
3.4.5. Xây dựng phác đồ phòng bệnh
Lô1. Dùng để làm đối chứng ( Không được tiêm vaccin phòng bệnh) Lô 2. Dùng để nghiên cứu ( Được tiêm vaccin phòng bệnh)
Trình tự thí nghiêm như sau :
- Bước 1 : Tạo độ thông thoáng chuồng nuôi, mật độ nuôi hợp lý, vệ sinh thức ăn, máng uống, … chế độ dinh dưỡng cho cả 2 lô lợn tương đương nhau.
- Bước 2 : Tiêm vacxin phòng bệnh M+ PAC với liều lượng 2ml/con vào 42 ngày tuổi cho lợn lô 2.
- Bước 3 Gây bệnh thực nghiệm : Chúng tôi lấy tổ chức phổi và hạch phổi của lợn bị bệnh suyễn, nghiền nhỏ, hòa nước theo tỷ lệ 1/20, để lắng, lấy phần trong nhỏ vào mũi lợn theo tỷ lệ 5ml/con vào ngày thứ 15 sau khi tiêm vaccin cho lợn ở cả 2 lô rồi tiến hành theo dõi những biểu hiện triệu chứng cũng như những biến đổi một số chỉ tiêu ( Thân nhiêt, Tần số hô hấp, tần số mạch) từ đó đánh giá kết quả thí nghiệm.
3.3.6. Điều trị thử nghiệm+ chuẩn bị lợn thí điều trị + chuẩn bị lợn thí điều trị
Chúng tôi tiến hành điều trị trên những lợn đã được xác định là bị suyễn bằng kỹ thuật Elisa và lợn bị bệnh trong quá trình gây bệnh thực nghiệm, tất cả lợn được điều trị đều mắc bệnh ở thể cấp tính. Chia lợn thành 2 lô, mỗi lô điều trị theo một phác đồ
- Phác đồ 1 ( Lô1) : Dùng Citius 5% do Công ty Liên doanh Virbac sản xuất với liều 1.5ml/25kg thể trọng/ngày, tiêm bắp trong 3 ngày. Tiếp đó dùng thuốc trợ sức trợ lực Injactavit với liều 1ml/con/ngày rồi theo rõi những biến đổi lâm sàng sau thời gian điều trị.
- Phác đồ 2 ( Lô2 ): Chúng tôi cũng tiến hành như phác đồ 1 và tiêm thêm Dexametasol với liều 1ml/10kgTT/ngày và theo dõi triệu chứng lâm sàng sau thời gian điều trị.