- Pipet, pipetman
c.Chọn khuẩn lạc đặc tr−ng vμ xác định hình thái khuẩn lạc
- Chọn những khuẩn lạc đặc tr−ng, lấy một vòng que cấy khuẩn lạc cho vμo n−ớc cất vô trùng, sau đó pha loãng với các nồng độ thích hợp, chọn nồng độ pha loãng sao cho khi cấy 0,1 ml vμo đĩa thạch sẽ xuất hiện các khuẩn lạc giống nhau riêng rẽ.
- Đặt vμo tủ ấm 370C trong 24 giờ.
- Tiến hμnh quan sát các khuẩn lạc nμy từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về kích th−ớc, hình dạng mép, hình dạng khuẩn lạc, bề mặt, độ dμy, có núm hay không, độ trong, mμu sắc (trên, d−ới, có khuếch tán ra môi tr−ờng hay không).
2.4.3.3 Ph−ơng pháp nhuộm Gram [7, 21 ]
Đây lμ ph−ơng pháp nhuộm vi khuẩn của Christian Gram. Nhuộm Gram không những giúp phân biệt vi khuẩn nhờ các đặc điểm hình thái vμ sự sắp xếp của tế bμo mμ còn cung cấp thông tin về lớp vỏ tế bμo. Khi nhuộm theo ph−ơng pháp nμy, tế bμo vi khuẩn Gram d−ơng có lớp vỏ tế bμo dμy tạo bởi peptidoglycan sẽ có mμu tím, còn vi khuẩn Gram âm có lớp vỏ tế bμo mỏng hơn (do có ít peptidoglycan hơn) vμ đ−ợc bao bọc bởi một lớp mμng mỏng sẽ có mμu hồng.
a. Hóa chất
Gentian violet 1g
R−ợu êtylic 960 10ml
Phênol đã tinh chế lại 5g
N−ớc cất 100ml
1)
2)
b. Cách tiến hμnh
- Dùng que cấy lấy từ 1 đến 2 giọt canh tr−ờng chứa vi khuẩn cần quan sát bôi lên phiến kính rồi để khô.
- Cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ phiến kính lên ngọn lửa đèn cồn.
- Nhuộm tím gentian trong 1 phút rồi rửa bằng n−ớc cất không quá 2 giây (cho dòng n−ớc chảy nhẹ qua tiêu bản, tránh không xối lên vết bôi).
- Ngâm trong dung dịch lugol 1 phút.
- Tẩy mμu bằng cồn trong 30 giây vμ rửa lại bằng n−ớc cất.
- Lμm khô vết bôi vμ nhuộm bổ sung bằng dung dịch fuchsin trong 10 – 30 giõy. - Rửa lại bằng n−ớc cất rồi hơ qua đèn cồn cho khô.
- Kết quả: Tế bμo bắt mμu tím lμ vi khuẩn Gram +, tế bμo bắt mμu hồng lμ vi khuẩn Gram -.
2.4.3.4 Ph−ơng pháp xác định sự có mặt của vi khuẩn nitrate hóa
Pha một l−ợng n−ớc có (NH4)2SO4 vμ một l−ợng n−ớc thải với bùn, lắc trong một thời gian thích hợp (khoảng 1 -2h), phân tích l−ợng NH4+ đầu vμ cuối, nếu NH4+ giảm thì chứng tỏ có vi khuẩn nitrate hóa. Sau khi lắc để yên, phân tích l−ợng NO3- đầu vμ cuối, nếu giảm thì chứng tỏ có vi khuẩn phản nitrate hóa.
2.4.4 Ph−ơng pháp hóa sinh
2.4.4.1 Ph−ơng pháp xác định các hoạt tính enzyme của bùn hoạt tính và màng sinh học
Khi các enzyme amylase, protease, cellulose tác dụng lên cơ chất thích hợp lần l−ợt lμ tinh bột tan, casein, CMC trong môi tr−ờng thạch, cơ chất bị phân giải lμm cho độ đục của môi tr−ờng bị giảm đi, môi tr−ờng trở nên trong suốt. Độ trong suốt đ−ợc tạo ra của môi tr−ờng tỉ lệ với độ hoạt động của enzyme.
Cách tiến hμnh:
- Chuẩn bị môi tr−ờng thạch có chứa cơ chất thích hợp (tinh bột tan, casein, CMC) đ−ợc phân đều vμo các đĩa petri. Sau khi thạch đông, đục những giếng nhỏ có đ−ờng kính 8 mm trên bề mặt thạch, dùng pipetman lấy dịch bùn cấy vμo các lỗ khoan, giữ ở 370C. Sau 24 giờ, kiểm tra vòng phân giải của bùn.
- Sau một thời gian thí nghiệm
+ Nhỏ dung dịch lugol, nếu bùn có hoạt tính sinh enzyme amylase vμ cellulose sẽ tạo thμnh các vòng sáng xung quanh giếng thạch.
+ Nhỏ dung dịch HgCl2, nếu bùn có hoạt tính sinh enzyme protease sẽ tạo thμnh các vòng sáng xung quanh giếng thạch.
2.4.4.2 Ph−ơng pháp kiểm tra hoạt tính amylase, protease, cellulase của các loại vi khuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khi các enzyme amylase, protease, cellulase tác dụng lên cơ chất thích hợp (tinh bột tan, casein, CMC) trong môi tr−ờng thạch, cơ chất bị phân giải lμm cho độ đục của môi tr−ờng bị giảm đi, môi tr−ờng trở nên trong suốt. Độ trong suốt đ−ợc tạo ra của môi tr−ờng tỉ lệ với độ hoạt động của enzyme.
Cách tiến hμnh:
- Chuẩn bị môi tr−ờng thạch có chứa cơ chất thích hợp (tinh bột tan, casein, CMC) đ−ợc phân đều vμo các đĩa petri.
- Cấy chấm điểm các chủng vi khuẩn lên bề mặt thạch. Sau 24 giờ ủ ở 370C, kiểm tra vòng phân giải xuất hiện xung quanh khuẩn lạc.
- Nhỏ dung dịch lugol, nếu bùn có hoạt tính sinh enzyme amylase vμ cellulase sẽ tạo thμnh các vòng sáng xung quanh giếng thạch.
- Nhỏ dung dịch HgCl2, nếu bùn có hoạt tính sinh enzyme protease sẽ tạo thμnh các vòng sáng xung quanh giếng thạch.
2.4.4.3 Ph−ơng pháp xác định khả năng sinh enzyme catalase [2, 22]
Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 nồng độ 10% lên phiến kính, dùng đầu que cấy lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hóa (24h) trộn vμo giọt H2O2 trên phiến kính. Nếu chủng vi khuẩn nμo sinh enzyme catalase sẽ tạo thμnh bọt khí trên phiến kính.
2.4.5. Ph−ơng pháp xử lí số liệu
Chương 3: