- Nghiên cứu sản xuất, kiểm tra và thử nghiệm EM1 (EM thứ cấp) và
3.3.2.Phơng pháp kiểm tra vi khuẩn trong phân.
∗Phơng pháp xác định tổng số vi khuẩn.
Xác định tổng số vi khuẩn có mặt trong phân gà bằng phơng pháp xét nghiệm vi sinh trên thạch Plate count Argar với các kỹ thuật xét nghiệm vi sinh vật học thờng quy trong phòng thí nghiệm và phơng pháp nghiên cứu thông dụng.
Phơng pháp xác định đợc tiến hành theo trình tự nh sau:
Mẫu đợc pha loãng với các nồng độ 10-1, 10-2,, 10-3 … , dùng pipet hút 0,1 ml ml dung dịch đã đợc pha loãng trên cấy vào môi trờng thạch (mỗi nồng độ cấy 2 đĩa). Để tủ ấm 370C trong 24 giờ sau đó đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trờng thạch (Trên môi trờng đặc, mỗi vi khuẩn đứng riêng rẽ sẽ phát triển thành một khuẩn lạc riêng biệt) từ đó tính ra số lợng vi khuẩn có trong một đơn vị mẫu nghiên cứu. Theo phơng pháp đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi tr- ờng thạch của Nguyễn Vĩnh Phớc(1994), kết quả đợc tính theo công thức:
a+b+c+d
∑CFU/g = ì F
n1.1+ n2..0,1
a,b.c.d : Số khuẩn lạc có trong 4 đĩa thạch. n1 : Số đĩa thạch ở nồng độ pha loãng thấp. n2 : Số đĩa thạch ở nồng độ pha loãng cao hơn.
F : Hệ số pha loãng khi bắt đầu. ∗Phơng pháp xác định vi khuẩn E.coli.
Sử dụng các môi trờng tăng sinh và môi trờng thạch L – EMB để nuôi cấy và kiểm tra vi khuẩn E.coli.
Vi khuẩn có khả năng lên men và sinh hơi đờng Lactose làm pH của môi trờng giảm.
Cách tiến hành: Cân vô trùng 25g mẫu cho vào bình trộn tốc độ cao có chứa 225ml dung dịch nớc đệm peptol. Tiếp tục pha loãng đến nồng độ cần thiết (10-2, 10-3…)
Từ mỗi độ pha loãng trên hút 1ml dung dịch cho vào mỗi ống LT, lắc đều và nuôi trong tủ ấm 350C trong 48 giờ. Kiểm tra các ống dơng tính ( có hình thành ga và có hiện tợng đục nhẹ do lên men đờng). Từ các ống LT dơng tính, dùng que cấy vòng chuyển 1 ăng đầy vào môi trờng EC và nuôi trong bể nớc ấm 450C trong 48 giờ. Kiểm tra các ống dơng tính (có hình thành ga và có hiện tợng vẩn đục).
Từ các ống EC dơng tính đã đợc kiểm tra ở trên lấy 1 ăng đầy ria cấy trên thạch L – EMB sau đó nuôi ở tủ ấm 350C trong 18 – 24 giờ. Kiểm tra các đĩa có khuẩn lạc. Khuẩn lạc E.coli điển hình có trung tâm đen, có hoặc không có ánh kim.
Lấy ít nhất 2 khuẩn lạc điển hình nhất từ mỗi điã thạch L – EMB cấy chuyển vào thạch nghiêng, nuôi ở tủ ấm 350C trong 24 giờ. Nhuộm Gram.
Giám định E.coli băng các phản ứng sinh hoá nh : Indol, VP, Citrat và phản ứng lên men đờng. Vi khuẩn có khả năng lên men và sinh hơi đờng lactose.
∗ Phơng pháp xác định vi khuẩn yếm khí.
Sử dụng môi trờng thạch TSC để kiểm tra vi khuẩn yếm khí.
Hút 25 ml mẫu cho vào bình tam giác vô trùng chứa 225 ml dung dịch pha loãng Peptol, trộn đều trong 1-2 phút ở tốc độ 10.000 – 12.000 vòng/phút ta đ-
ợc dung dịch pha loãng 1/10. Tiếp tục pha loãng đến các nồng độ cần thiết(10-2, 10-3,10-4, ).…
Đổ 6 –7 ml thạch TSC (có bổ sung kháng sinh) vào một đĩa petri, lắc đều, để khô. Cấy chuyển 1ml của mỗi nồng độ pha loãng vào giữa từng đĩa thạch, mỗi nồng độ cấy 2 đĩa. Sau đó đổ thêm 15ml thạch TSC (có bổ sung kháng sinh) vào đĩa. Trộn đều với dung dịch nuôi cấy bằng cách lắc nhẹ .Để khô,đặt vào bình yếm khí sau đó để vào tủ ấm 370C trong vòng 20-24 giờ.
Tính kết quả : Đếm các khuẩn lạc màu đen trên môi trờng thạch rồi tính toán số lợng vi khuẩn yếm khí có trong 1 gam mẫu nh công thức tính toán tổng số vi khuẩn yếm khí theo công thức sau:
Aì1000 Số vi khuẩn =
SìK
A: Số khuẩn lạc trên đĩa thạch. S: Diện tích hộp lồng.
K: Hệ số thời gian lấy mẵu.
( K=1 với thời gian lấy mẫu 5 phút). ( K=2 với thời gian lấy mẫu 10 phút).
Khẳng định sự có mặt của vi khuẩn Clostridium perfringer bằng nhuộm Gram, khả năng di động và sự phát triển của nó trên môi trờng đặc hiệu nuôi cấy yếm khí.