- Si O Si + (C H) SiNHSi(CH ) Si O Si + NH OH OH ( CH ) SiO OSi(CH )
3.6.2.Các vấn đề thực nghiệm
Chương 3: SẮC KÍ LỎNG (LIQUID CHROMATOGRAPHY)
3.6.2.Các vấn đề thực nghiệm
3.6.2.1. Cột và các thủ tục nhồi cột
Sắc kí cột mở được thực hiện chủ yếu trong các cột thủy tinh. Kích thước của cột phụ thuộc vào số lượng của chất cần tách. Cột nhỏ nhất có đường kính chỉ vài milimet và chiều dài vài cm, trong khi đó cột lớn nhất có thể vài cm đường kính và chiều dài tương ứng dài hơn.
Để thu được hiệu quả lớn nhất cột phải được nhồi thích hợp. Ảnh hưởng của kích thước hạt và thủ tục nhồi cột đã được thảo luận trong chương trước. Do phương pháp sử dụng trọng lực của dung môi chảy xuyên qua cột nên kích thước hạt nhồi phải > 150 micromet để thu được những tốc độ dòng chảy có thể chấp nhận được. Cột phải được nhồi đồng nhất để làm giảm thiểu đến mức nhỏ nhất sự biến dạng của sắc kí.
dòng mỏng vào vào trong cột. Nếu kích thước hạt là đồng nhất thì cột dễ hơn để nhồi. Khi nhồi cột hoặc trong quá trình tách không được để cho cột khô ở bất kì vị trí nào vì như vậy dẫn đến không khí xâm nhập vào các vị trí đó.
3.6.2.2. Nạp mẫu
Mẫu nên được đưa vào đầu cột khi chuẩn bị xong cột và được pha với một lượng dung môi dùng rửa giải thích hợp. Phần trên của cột có thể được bảo vệ bởi một lớp bông thủy tinh, giấy lọc…
Khi tất cả mẫu được hấp phụ hết thì rót dung môi rửa giải vào và tiến hành sắc kí. Dung môi có thể được nạp liên tục theo yều cầu của phép tách.
3.6.2.3. Các thủ tục rửa giải
Có ba thủ tục rửa giải chính: rửa giải đồng hệ (isocratic), rửa giải phân đoạn fractional (stepwise) và rửa giải biến thiên gradient:
Isocratic là thủ tục rửa giải với hỗn hợp dung môi có thành phần không thay đổi trong quá trình chạy sắc kí cho đến khi hoàn thành sự tách.
Factional là thủ tục rửa giải sử dụng một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp để cô lập và tách một hoặc một nhóm cấu tử cần tách trong mẫu. Thỉnh thoảng có thể sử dụng nhiều dung môi khác nhau có lực rửa giải tăng dần để tách các cấu tử hoặc nhóm cấu tử khác nhau.
Gradient là thủ tục sử dụng môi trường rửa giải được thay đổi liên tục, nghĩa là nồng độ của các dung môi trong hỗn hợp được thay đổi biến thiên đều theo thời gian. Ảnh hưởng của thủ tục này là có thể rửa giải lần lượt các chất hấp phụ mạnh dần và giảm hiện tượng kéo đuôi. Điều này có nghĩa là các dải sắc kí sẽ có khuynh hướng đậm dặc hơn trong cột và chiếm trên cột ít hơn.