- Si O Si + (C H) SiNHSi(CH ) Si O Si + NH OH OH ( CH ) SiO OSi(CH )
3.3.5.Sắc kí loại theo cở (Size Exclusion Chromatography)
Chương 3: SẮC KÍ LỎNG (LIQUID CHROMATOGRAPHY)
3.3.5.Sắc kí loại theo cở (Size Exclusion Chromatography)
Sắc kí loại theo cở hay còn gọi là sắc kí trên gel là một công cụ mạnh cho phân tích các chất có khối lượng phân tử lớn.
Chất nhồi cột cho sắc kí này là các hạt nhỏ (cở 10 micromet) polime hoặc silica chứa mạng lưới các lỗ đồng nhất trong đó các chất tan và dung môi có thể khuếch tán vào. Trong các lỗ đó các phân tử bị bẫy một cách hiệu quả và bị tách từ dòng chảy của pha động.
Thời gian cư ngụ trung bình trong các lỗ phụ thuộc vào kích thước hiệu dụng của các phân tử. Các phân tử có kích thước lớn hơn so với kích thước trung bình của các lỗ của chất nhồi thì không bị lưu giữ.
Còn các phân tử có đường kính nhỏ hơn đáng kể kích thước lỗ thì thâm nhập càng sâu vào trong sâu lỗ và như vậy cần nhiều thời gian hơn để ra khỏi lỗ, dẫn đến bị rửa giải ra sau cùng.
Nằm giữa hai loại này là các phân tử có kích thước trung bình sẽ xâm nhập vào trong các lỗ nhiều hay ít tùy thuộc đuồng kính của chúng.
Chất nhồi cột
Có hai loại: Các hạt polime và silica có đường kính từ 5 đến 10 micromet. Loại sau cứng hơn nên dễ nhồi cột, bền hơn, cho phép sử dụng một khoảng rộng các dung môi bao gồm cả nước, cân bằng thiết lập nhanh hơn trong những dung môi mới, và bền ở nhiệt độ cao hơn.
Những nhược điểm của hạt silica là có khuynh hướng lưu giữ chất tan bởi sự hấp phụ và có thể có tiềm năng xúc tác cho các phản ứng phân hủy các phân tử chất tan.
Hầu hết sắc kí loại theo cở đầu tiên được thực hiện trên chất nhựa đồng trùng hợp giữa divinyl benzene với styrene. Kích thước lỗ của loại polime này được kiểm soát bởi sự mở rộng liên kết ngang và vì thế liên quan đến phần trăm divinylbenzen sử dụng để sản xuất nhựa. Vì vậy có nhiều loại gel với kích cở lỗ khác nhau.
Lúc đầu, các nhựa đồng trùng hợp này là kỵ nước và chỉ được sử dụng với pha động là các dung môi không nước.
Hiện nay, các gel ưa nước là có sẵn (ví dụ poliacrylamide) dẫn dến có thể sử dụng dung môi nước cho các phép tách các phân tử chất tan trong nước ví dụ các loại đường.
Các loại silica và hạt thủy tinh có kích thước lỗ trung bình của khoảng 40 đến 2500 Ao hiện có sẵn trên thị trường. Để giảm sự hấp phụ, bề mặt của những chất này thường được chuyển hóa bởi những chất thế hữu cơ. Ví dụ bề mặt của một chất nhồi ưa nước có cấu trúc: OH OH │ │ │ —Si—CH2—CH2—CH2—CH2—O—CH2—CH—CH2 │ Phương trình rửa giải:
Trong sắc kí theo gel thể tích của pha động Vm thường được gọi là thể tích rỗng (Void volume) Vo. Đại lượng Kav được định nghĩa là:
Kav = (Vr – Vo)/(Vt - Vo) Ở đây
o Vr là thể tích lưu của một chất tan,
o Vt là thể tích tổng của cột = πr2 với r là bán kính).
o Đối với một phân tử lớn và không xâm nhập vào gel thì Vr = Vo và Kav = 0. o Đối với các phân tử nhỏ xâm nhập tự do vào gel thì Vr ≈ Vt và Kav ≈ 1.
o Các phân tử có kích thước trung bình xâm nhập một phần vào các lỗ thì có Kav nằm trong khoảng từ 0 đến 1. Thực tế do luôn luôn có sự hấp phụ nên Kav luôn luôn lớn hơn 1.
Thể tích rỗng được đo bởi cho một loại phân tử trơ có kích thước lớn đi qua cột. Thể tích rửa giải của nó chính là Vo.
Hình 3.4: Sơ đồ cấu trúc một poliacrylamide
3.4. Pha động