- Si O Si + (C H) SiNHSi(CH ) Si O Si + NH OH OH ( CH ) SiO OSi(CH )
3.4.4.Tách bằng pha động có thành phần biến đổi đều (Gradient separations)
Chương 3: SẮC KÍ LỎNG (LIQUID CHROMATOGRAPHY)
3.4.4.Tách bằng pha động có thành phần biến đổi đều (Gradient separations)
Nhiều trường hợp mẫu chứa nhiều cấu tử có độ phân cực khác nhau trong khoảng rộng nên một phép tách với pha động không thay đổi thành phần có thể dẫn đến :
- Một số cấu tử có hệ số dung lượng k’ nhỏ còn một số thì rất lớn nên khi lực rửa giải của pha động đủ thấp để phân giải các pic ra đầu tiên thì sự rửa giải các pic sau cùng rất chậm làm kéo dài thời gian phân tích và lãng phí dung môi.
- Một số pic có thể bị kéo đuôi.
Để đạt được độ phân giải nhưng giảm thời gian phân tích, một sự biến đổi nồng độ thành phần nên được chọn.
Phát triển phép tách gradient.
Bước đầu tiên nên khảo sát trong một khoảng rộng của lực rửa giải theo chế độ không thay đổi thành phần dung môi (isocratic elution), từ 10 đến 100% nồng độ của dung môi hữu cơ mạnh ví dụ acetonitril trong nước.
o Điều này giup ta xác định được các giá trị k’ của các cấu tử có trong mẫu cho mỗi trường hợp.
o Nếu các giá trị k’ của các cấu tử khá gần nhau thì trong sắc kí pha đảo ta có thể giảm nhẹ thành phần dung môi hữu cơ xuống sẽ giúp cải thiện độ phân giải. Nếu không thì thay đổi dung môi khác hoặc thay đổi pha tĩnh.
o Nếu các giá trị k’ của các (hoặc một số) cấu tử có k’ khác nhau khá lớn và vượt ngoài khoảng 5-10 thì nên sử dụng chế độ rửa giải có thành phần pha động biến đổi đều (gradient).
Bước tiếp theo là trãi các pic rộng ra bằng cách chọn khoảng biến thiên gradient hẹp hơn:
Acetonitril/H2O
Metanol/H2O
o Biểu đồ gradient biểu diễn sự phụ thuộc của thời gian từ lúc tiêm mẫu với % của dung môi acetonitril của sắc đồ (a) trong hình 3.8 tăng đều từ 10 dến 90 % trong 40 phút (với thời gian chờ dung môi là gần 5 phút).
Pic 1 được rửa giải ở thời điểm phút 14 khi thành phần dung môi là 28% và pic 8 được rửa giải gần 35.5 phút tương ứng thành phần % dung môi là 71%. Như vậy sự biến thiên thành phần dung môi từ 10 đến 28% và từ 71 đến 90 % là không cần thiết. o Vì thế trong lần chạy sắc kí thứ hai có thể thay đổi thành phần pha động tuyến tính
acetonitril từ 28 đến 71% trong thời gian 40 phút. Trong sắc đồ (b) điều kiện được chọn hơi khác một ít là từ 30 đến 82% trong 40 phút. Kết quả các pic được trải rộng hơn và thời gian các pic tách khỏi nhau còn 32 phút.
Trong sắc kí (c), ta muốn xem thử liệu có thể sử dụng khoảng gradient hẹp hơn để giảm thời gian chạy sắc kí. Thành phần dung môi pha động trong lần này biến đổi như trong (b) nhưng trong khoảng thời gian 20 phút. Kết quả sắc đồ (c) cho thấy các pic 6 và 7 không được phân giải hoàn toàn nên sắc kí đồ (b) hợp lí cho phép tách gradient.
Nếu phép tách trong sắc kí đồ (b) không thể chấp nhận thì ta có thể thử cải thiện nó bằng cách giảm tốc độ dòng pha động hoặc tiến hành gradient phân đoạn. Lí lẽ của gradient phân đoạn là để sử dụng thành phần dung môi tốt cho mỗi vùng của sắc kí đồ và sau đó tăng % của pha động cho vùng tiếp theo. Điều này tiến hành dễ dàng.
Với tất cả các công cụ trên, ta có thể tìm ra cách các cấu tử của một hỗn hợp nếu nó không chứa quá nhiều cấu tử. Nếu sắc kí pha đảo thất bại cần chuyển sang một phương pháp khác như sắc kí pha thuận.
Hình 3.8: Các phép tách gradient tuyến tính của cùng một mẫu được sử dụng ở trên trong cùng một cột tách và hệ thống dung môi ở tốc độ dòng 1.0 ml/phut. Thời gian chờ dung môi là 5 phút.