CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.3. Phân tích định tính các dịch chiết toàn phần và phân đoạn dịch chiết theo quy trình đề xuất
quy trình đề xuất
Các mẫu được mã hóa trong Bảng 2.1 được tiến hành xử lý như trong quy trình mô tả ở mục 2.3.2 (
Hình 3.3). Kết quả thu được như sau: 3.3.1.1. Sắc ký đồ
Dịch chiết toàn phần, phân đoạn ethylacetat, phân đoạn n-butanol được khai triển sắc ký với hai hệ dung môi là S.2 và F.11 thu được 6 bản sắc ký đồ. Kết quả cho thấy các phân đoạn dịch chiết tách tốt với hệ dung môi S.2 và tách kém hơn với hệ dung môi F.11. Dịch chiết toàn phần và phân đoạn ethylacetat cho nhiều vạch sắc ký đối với cả hai hệ dung môi, trong đó có nhiều vạch xuất hiện ở tất cả các mẫu (vạch đặc trưng chi) và một vài vạch chỉ xuất hiện ở những mẫu cùng loài (vạch đặc trưng loài). Phân đoạn n-butanol có nhiều sự khác biệt nhất giữa các mẫu, trong đó, mẫu GL3, GS2 và GY1 không xuất hiện vạch nào dưới UV 366nm và khi hiện màu bằng dung dịch acid sulfuric 10%. Do vậy, việc xác định các vết đặc trưng dựa trên sắc ký đồ của dịch chiết toàn phần và phân đoạn ethylacetat.
Vạch đặc trưng chi: Dựa trên sắc ký đồ Hình 3.4 và Hình 3.5, quan sát được các vạch sắc ký xuất hiện ở tất cả các mẫu, đó là các vạch đặc trưng chi. Giá trị Rf của các vạch này được thể hiện trong Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Giá trị Rf của các vạch đặc trưng chi Gymnema R. Br.
Hệ dung môi pha động
Quan sát Phân đoạn dịch chiết khai triển
Dịch chiết toàn phần Phân đoạn ethylacetat
Hệ S.2 UV 254nm 0,89; 0,84 0,64 UV 366nm 0,47 0,88; 0,66; 0,47 VIS – H2SO4 0,46; 0,25 0,20; 0,66 Hệ F.11 UV 254nm Không có Không có UV 366nm 0,59; 0,49 0,59; 0,49 VIS – H2SO4 0.55 Không có
Hình 3.4. Sắc ký đồ khai triển dịch chiết toàn phần và phân đoạn ethylacetat với hệ dung môi S.2
Hình 3.5. Sắc ký đồ khai triển dịch chiết toàn phần và phân đoạn ethylacetat với hệ dung môi F.11
Vạch đặc trưng loài: Từ các sắc ký đồ có thể xác định được một số vạch sắc ký đặc trưng cho các loài nghiên cứu.
1. Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Schult.:
Vạch đặc trưng loài: Trên sắc ký đồ khai triển dịch chiết toàn phần với hệ dung môi S.2 và quan sát dưới UV 254nm, các vạch sắc ký tại Rf 0,31 và 0,06 chỉ xuất hiện ở 4 mẫu thuộc loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Schult.. Khi hiện màu bằng dung dịch acid sulfuric 10% thì xuất hiện vạch sắc ký đặc trưng cho loài
Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Schult. ở Rf 0,14. Trên sắc ký đồ khai triển phân đoạn ethylacetat với hệ dung môi S.2 và hiện màu bằng dung dịch acid sulfuric 10% thì quan sát được một nhóm vạch đặc trưng tại Rf 0,66; 0,57; 0,51; 0,47; 0,42 và 0,09 (Hình 3.4).
Sự khác biệt giữa các mẫu trong cùng một loài: Các mẫu của loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Schult. có sự tương đồng lớn. Tuy nhiên, trên bản sắc ký đồ khai triển dịch chiết toàn phần với hệ dung môi S.2, hiện màu bằng dung dịch acid sulfuric 10%, vạch sắc ký tại Rf 0.63 xuất hiện ở cả 3 mẫu GS3, GS4, GS5 nhưng không có ở mẫu GS2 (Hình 3.6). Như vậy, tồn tại sự khác biệt giữa mẫu GS2 với 3 mẫu GS3, GS4, GS5.
2. Gymnema inodorum (Lour.) Decnc:
Vạch đặc trưng loài: Trên sắc ký đồ khai triển dịch chiết toàn phần với hệ dung môi S.2 và quan sát ở UV 254nm và UV 366nm, quan sát được vạch sắc ký có huỳnh quang màu xanh ở Rf 0,07 rất đặc trưng của 2 mẫu loài Gymnema inodorum
(Lour.) Decnc. Vạch sắc ký này cũng xuất hiện ở sắc ký đồ phân đoạn ethylacetat với hệ dung môi S.2 của 2 mẫu loài Gymnema inodorum (Lour.) Decnc. (Hình 3.4). Trên sắc ký đồ khai triển phân đoạn ethylacetat với hệ dung S.2, dưới UV 366nm còn xuất hiện vạch có huỳnh quang xanh tại Rf 0,55 chỉ có ở 2 mẫu của loài
Gymnema inodorum (Lour.) Decnc. (Hình 3.4). Với hệ dung môi F.11, trên bản sắc ký hiện màu bằng dung dịch acid sulfuric 10%, dịch chiết toàn phần của 2 mẫu GI1 và GI2 cho 2 vạch sắc ký tại Rf 0,61 và 0,58 thay vì 1 vạch sắc ký tại Rf 0,60 như ở các mẫu còn lại (Hình 3.5).
Sự khác biệt giữa các mẫu trong loài: Trên sắc ký đồ khai triển dịch chiết toàn phần với hệ dung môi S.2, quan sát ở UV 254nm và hiện màu bằng dung dịch acid sulfuric 10%, vạch sắc ký ở Rf 0,75 xuất hiện ở mẫu GI1 nhưng không có ở mẫu GI2 (Hình 3.7 – a, b). Trên sắc ký đồ khai triển phân đoạn ethylacetat với hệ dung môi S.2, quan sát ở UV 254nm và hiện màu bằng dung dịch acid sulfuric 10%, 2 vạch sắc ký ở Rf 0,69 và 0,50 cũng có ở mẫu GI1 nhưng không có ở mẫu GI2 (Hình 3.7 – c,d). Với hệ dung môi F.11, hiện màu bằng dung dịch acid sulfuric 10%, vạch sắc ký tại Rf 0,26 và 0,22 xuất hiện ở dịch chiết toàn phần GI1 nhưng không có ở mẫu GI2. Ngược lại, dịch chiết toàn phần GI2 cho vạch màu xanh tại Rf 0,47 mà mẫu GI1 không có (Hình 3.7 – e).
3. Gymnema yunnanense Tsiang:
Từ các bản sắc ký đồ, quan sát thấy không có vạch sắc ký nào chỉ xuất hiện ở mẫu Gymnema yunnanense Tsiang, nhưng sắc ký đồ của mẫu GY1 cũng không giống hoàn toàn với các mẫu còn lại. Do đó, dựa vào sắc ký đồ vẫn có khả năng phân biệt mẫu GY1 với các mẫu còn lại.
4. Gymnema latifolium Wallich ex Wight.:
Giống như loài Gymnema yunnanense Tsiang, dựa vào sắc ký đồ, không nhận thấy được vạch sắc ký đặc trưng cho loài. Từ sắc ký đồ, 4 mẫu Gymnema latifolium Wallich ex Wight. có sự khác biệt nhất định ở một số vạch sắc ký. Với hệ dung môi S.2, quan sát ở UV 366nm, dịch chiết toàn phần của 3 mẫu GL1, GL3, GL4 cho vạch sắc ký đậm tại Rf 0,58 nhưng vạch này không xuất hiện ở mẫu GL2. Trong khi đó, tại vị trí Rf 0,35, vạch màu xanh xuất hiện ở mẫu GL2 nhưng không có ở các mẫu còn lại (Hình 3.8 – a). Khi hiện màu bản này bằng dung dịch acid sulfuric 10%, GL4 cho vạch sắc ký màu xanh tím tại Rf 0,61 trong khi 3 mẫu còn lại không có (Hình 3.8 – b). Cũng với hệ dung môi này, phân đoạn ethylacetat của cả 4 mẫu đều cho vạch sắc ký tại Rf 0,35 và 0,27 nhưng màu sắc các vạch lại khác nhau. 4 vạch này của mẫu GL3 và GL4 đều có màu đỏ, trong khi đó, vạch sắc ký tại Rf 0,27 của mẫu GL1 và GL2 có màu xanh và vạch sắc ký tại Rf 0,35 có màu xanh dương (Hình 3.8 – c).
5. Gymnema sp.:
Với hệ dung môi S.2, quan sát ở UV 366nm, cả dịch chiết toàn phần và phân đoạn ethylacetat đều cho vạch sắc ký huỳnh quang xanh da trời tại Rf 0,37 (Hình 3.4). Với hệ dung môi F.11, quan sát ở UV 366nm, cả dịch chiết toàn phần và phân đoạn ethylacetat đều cho vạch sắc ký huỳnh quang xanh ở Rf 0,25 (Hình 3.5).
Hình 3.6. Sự khác biệt giữa các mẫu của loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Schult
Hình 3.7. Sự khác nhau giữa các mẫu của loài Gymnema inodorum(Lour.) Decnc.
Hình 3.8.Sự khác nhau giữa các mẫu của loài Gymnema latifoliumWallich ex Wight.
3.3.1.2. Hệ số tương đồng giữa các mẫu nghiên cứu
Kết quả khai triển sắc ký từ 3 phân đoạn dịch chiết của 12 mẫu với hai hệ dung môi S.2 và F.11 có 252 vạch sắc ký trong đó với độ đậm nhạt khác nhau. Các
vạch sắc ký được mã hóa nhị biến lập thành bảng (Phụ lục). Mối tương quan về thành phần hóa học được thể hiện qua hệ số tương đồng cặp đôi giữa các mẫu nghiên cứu, sử dụng chỉ số Nei&Li (Bảng 3.5). Hệ số tương đồng có giá trị từ 0,51 – 0,94. Trong đó, giá trị tương đồng cao nhất 0,94 có ở 2 mẫu GS4 và GS5 được trồng ở cùng một địa điểm là Thái Nguyên và thu hái cùng một thời điểm.
Bảng 3.5. Bảng hệ số tương đồng cặp đôi giữa các mẫu nghiên cứu, sử dụng chỉ số Nei&Li
GL1 GL2 GL3 GL4 GS1 GS2 GS3 GS4 GS5 GI1 GI2 GY1 GL1 1,00 GL2 0,80 1,00 GL3 0,89 0,79 1,00 GL4 0,76 0,78 0,79 1,00 GS1 0,72 0,68 0,71 0,62 1,00 GS2 0,66 0,60 0,66 0,62 0,62 1,00 GS3 0,66 0,64 0,66 0,70 0,62 0,86 1,00 GS4 0,61 0,60 0,64 0,68 0,62 0,82 0,89 1,00 GS5 0,62 0,60 0,65 0,66 0,59 0,81 0,86 0,94 1,00 GI1 0,61 0,57 0,62 0,65 0,51 0,69 0,64 0,60 0,60 1,00 GI2 0,58 0,59 0,60 0,69 0,60 0,60 0,64 0,65 0,62 0,72 1,00 GY1 0,71 0,65 0,71 0,65 0,70 0,70 0,62 0,61 0,60 0,67 0,65 1,00
3.3.1.3. Cây phân loại
Cây phân loại các mẫu được trình bày trong Hình 3.9. Ở mức độ tương đồng cao hơn 70%, các mẫu thuộc loài Gymnema R. Br. trong nghiên cứu được chia thành các nhóm:
Nhóm (I) tương ứng về mặt hình thái là các mẫu thuộc loài Gymnema latifolium Wall. Ex Wight.. Trong đó, mẫu GL1 (thu hái ở Thái Nguyên) và GL3 (thu hái ở Gia Lai) có hệ số tương đồng cao hơn 80%, sau đó là GL2 (thu
hái ở Tây Ninh) với hệ số tương đồng gần 80% và GL4 có nhiều khác biệt nhất với các mẫu khác trong loài với hệ số tương đồng khoảng 78%.
Nhóm (II) là mẫu GS1, mẫu Gymnema sp. thu hái ở CHDCND Lào. Nhóm (III) là mẫu GY1, mẫu Gymnema yunnanense Tsiang.
Nhóm (IV) bao gồm các mẫu thuộc loài Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Trong nhóm này, mẫu GS4 (mẫu hoa vàng) và GS5 (mẫu hoa đỏ), đều được thu hái Thái Nguyên, đạt hệ số tương đồng cao nhất 94%, tức là hầu như không có sự khác biệt về vị trí các vạch sắc ký. Mẫu GS3 có nhiều điểm tương đồng hóa học với GS4 và GS5 hơn so với mẫu GS2 mặc dù GS3 và GS2 đều là mẫu hoa trắng nhưng được trồng tại hai địa điểm khác nhau là Thái Nguyên và Thanh Hóa.
Nhóm (V) bao gồm 2 mẫu GI1 và GI2 thuộc loài Gymnema inodorum (Lour.) Decne. Hệ số tương đồng của hai mẫu thấp hơn so với các nhóm khác (khoảng 70%).
Hình 3.9. Cây phân loại dựa trên phân tích UPGMA hệ số tương đồng giữa sắc ký đồ của các mẫu
3.4. BÀN LUẬN