CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2. Xây dựng quy trình phân tích định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
mỏng
Các mẫu lá được tách chiết phân đoạn như trình bày trong Hình 1.3. Các phân đoạn thu được sẽ được phân tích định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Trong đó, một số yếu tố có ảnh hưởng đến quá trình phân tích, bao gồm: phương pháp chiết xuất và hệ dung môi pha động, khoảng khai triển và thể tích phun. Do vậy, cần tiến hành nghiên cứu sự ảnh hưởng của các yếu tố đó đến kết quả phân tích. Các thí nghiệm sàng lọc sau được tiến hành trên bột lá Gymnema latifolium Wall. ex Wight thu được tại Thái Nguyên.
2.3.2.1. Sàng lọc phương pháp chiết xuất:
Tiến hành chiết 10g bột dược liệu xay thô CX1, CX2, CX3 bằng 300ml methanol tuyệt đối bằng 3 phương pháp: Ngâm lạnh, Ngấm kiệt, Hồi lưu thu được các dịch chiết tương ứng: NL, NK, HL. Một lượng nhỏ dịch chiết thu được theo 3 phương pháp được dùng để chấm sắc kí với:
₋ Bản mỏng tráng sẵn Silica Gel GF254 (Merck) hoạt hóa ở 1100C trong 1h.
₋ Hiện màu ở UV 365nm hoặc nhúng thuốc thử hiện màu dung dịch acid sulfuric 10%, hơ nóng đến khi hiện màu.
Phần còn lại đem cô thành cắn và cân bằng cân kỹ thuật.
2.3.2.2.Sàng lọc hệ dung môi pha động trong phân tích TLC
Tiến hành chiết tách phân đoạn dịch chiết Gymnema latifolium Wallich ex Wight (mẫu DM) theo quy trình trình bày trong Hình 1.3 với phương pháp chiết xuất là phương pháp hồi lưu. Định tính các phân đoạn dịch chiết bằng các phản ứng thường quy trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2 để xác định nhóm chất chính sẽ tập trung phân tích. Tiến hành sàng lọc các hệ dung môi pha động thường dùng trong phân tích các nhóm chất đó và chọn ra hệ dung môi cho kết quả tách vết sắc ký tốt nhất.
Sắc ký lớp mỏng (TLC): Được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn TLC Silica Gel 60 F254 (Merck); phát hiện vết ở UV 366nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, sấy ở 90oC đến khi hiện màu.
Dựa vào kết quả định tính và sàng lọc thu được, đề xuất quy trình phân tích định tính các phân đoạn dịch chiết các mẫu đã thu hái và mã hóa trong Bảng 2.1.
2.3.3.Tiến hành phân tích định tính các phân đoạn dịch chiết một số loài trong chi Gymnema R.Br. theo quy trình đề xuất
Tiến hành phân tích định tính các mẫu theo quy trình đề xuất. Xác định các vạch đặc trưng chi và vạch đặc trưng loài:
- Vạch đặc trưng chi là vạch sắc ký xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu thuộc chi Gymnema R.Br. khi tiến hành phân tích với cùng một hệ dung môi pha động và quan sát, hiện màu với cùng một phương pháp.
- Vạch đặc trưng loài là vạch sắc ký xuất hiện ở tất cả các mẫu nghien cứu thuộc cùng một loài nhưng không có ở loài khác trong cùng chi khi tiến hành phân tích với cùng một hệ dung môi pha động và quan sát, hiện màu với cùng một phương pháp.
Đặc điểm về thành phần hóa học của các mẫu được thống kê qua kết quả sắc ký đồ thu được. Sự có mặt của các “vạch” trên sắc ký đồ được mã hóa nhị biến,
trong đó “1” là có vạch và “0” là không có vạch. Hệ số đồng dạng Sij của các mẫu được tính theo công thức của Nei & Li [24]:
Trong đó: Trong đó:
Sij : Hệ số đồng dạng
Nij : Số vạch chung của hai loài i và j Ni : Số vạch của loài i
Nj : Số vạch của loài j
Trên cơ sở bảng hệ số đồng dạng vạch trên sắc ký đồ của 12 mẫu nghiên cứu, thiết lập cây phân loại sử dụng phép phân tích chùm theo phương pháp khoảng cách kiên kết trung bình UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages), sử dụng phần mềm NT-SYS PC 2.02h (Numerical Taxonomy System Applied Biostatistics, New York).