Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên sự thay đổi màu của thuốc thử Bradford khi kết hợp với protein trong MT acid. Thuốc thử Bradford là hợp chất gồm Coomassie Brilliant Blue (CBB) G250 và phosphoric acid hòa tan trong ethanol:nước cất theo tỷ lệ 1:4. Trong MT mang tính acid, khi chưa gắn với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang màu xanh dương và hấp thụ cực đại ở bước sóng 595 nm. Vì vậy lượng protein có thể được biết bằng cách xác định thuốc nhuộm ở dạng tích điện màu xanh dương khi đo hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thu tỷ lệ thuận với HL protein có trong dung dịch.
Các bước tiến hành:
Chuẩn bị dung dịch Bradford: hòa tan 100mg Coomassie Brilliant Blue G250 trong 50ml ethanol 95% → cho thêm 100ml acid phosphoric 85% → khuấy đều → bổ sung thêm nước cất cho đến 1lít → Lọc dung dịch bằng giấy lọc Whatman No.1→ trữ trong chai tối ở nhiệt độ phòng.
Xây dựng đường chuẩn :
Chuẩn bị dãy protein BSA chuẩn với nồng độ tăng dần từ 0, 5, 10, 20, 30, 50 µg/ml • Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
• Chuẩn bị các ống eppendorf và thêm vào các chất theo bảng:
Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn BSA
Ống nghiệm số Hóa chất 1 2 3 4 5 6 7 Nồng độ BSA (µg/ml) 0 5 10 20 30 40 50 Thể tích BSA (µl) 0 5 10 20 30 40 50 Thể tích HR2RO cất (µl) 100 95 90 80 70 60 50 • Lắc đều các ống.
• Lấy 100 µl dung dịch từ các ống nghiệm trên cho vào một dãy ống nghiệm được đánh số tương tự.
• Cho vào mỗi ống 2ml thuốc thử.
• Lắc đều các ống bằng máy vortex để tránh không có bọt khí.
• Sau 10 phút tiến hành đo OD (định chuẩn máy quang phổ với dung dịch đệm (ống 1) ở bước sóng 595 nm. Chỉnh OD về giá trị 0. Tiến hành đo các ống còn lại)
• Ghi nhận lại kết quả.
• Tính giá trị trung bình 3 lần lặp lại.
• Vẽ biểu đồ đường chuẩn BSA thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với độ hấp thu (OD) ở bước sóng 595nm.
• HL protein trong mẫu cũng được tiến hành đo đồng thời với việc dựng đường chuẩn. Mẫu pha loãng 5 lần, 10 lần và 20 lần (đo lặp lại 3 lần)
• Lấy 100µl các mẫu pha loãng cho vào 2 ml dung dịch thuốc thử • Ghi nhận kết quả, lấy giá trị trung bình của 3 ống
• Từ phương trình đường chuẩn ta suy ra được HL protein trong dung dịch đo.