HT của chitinase được xác định theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS (3,5 – dinitrosalicylic acid) [10], [25], [43]
Nguyên tắc: HT chitinase được xác định dựa vào lượng đường khử N-acetyl-β-D-Glucosamine sinh ra ttrong phản ứng thủy phân. Khi cho chitinase tác dụng với cơ chất là chitin huyền phù, N- acetyl-β-D-Glucosamine sinh ra trong phản ứng được định lượng qua phản ứng với thuốc thử DNS (3,5 - dinitrosalisylic acid), cho sản phẩm 3-amino-5 nitrosalicylic acid hấp thụ ánh sáng khả kiến ở bước sóng 535nm.
+ + đường oxi hóa
Tiến hành
Chuẩn bị hóa chất
* Dung dịch đệm phosphate 0,2M, pH 6,5 N – Acetylglucosamine
- Dung dịch NaHR2RPOR4R 0,2M: cân 31,2g NaHR2RPOR4R.2HR2RO hòa tan và thêm nước cất đến 1000ml - Dung dịch NaR2RHPOR4 R0,2M: cân 71,6g NaR2RHPOR4R.12HR2RO hòa tan và thêm nước cất đến 1000 ml * Thuốc thử DNS
- Dung dịch A: hòa tan 300g muối Na-K tartrat kép vào trong 500ml nước cất. - Dung dịch B: hòa tan 10g 3,5-dinitrosalicylic acid vào 200ml dung dịch NaOH 2N
- Thuốc thử DNS dùng trong phản ứng: trộn dung dịch A với dung dịch B, thêm nước cất cho đủ 1 lít. Chỉ pha dung dịch DNS dùng cho phản ứng trước khi sử dụng, bảo quản trong chai nâu và tránh không khí
Dựng đường chuẩn N-acetyl-β-D-Glucosamine
Chuẩn bị dung dịch chuẩn N-acetyl-β-D-Glucosamine (10µmol/ml): cân chính xác 0,1105g N- acetyl- β -D-Glucosamine, cho nước cất vào đủ 50 ml.
Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn Glucosamine.
Chuẩn bi dãy dung dịch N-acetyl-β-D-Glucosamine với các nồng độ khác nhau từ0- 7(µmol/ml)
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 6 7 Nồng độ N-acetyl-β-D-Glucosamine
(µmol/ml)
0 0,5 1 1,5 2,0 2,5 3.0 3.5
Thể tích dung dịch chuẩn (10µmol/ml) N-acetyl- β -D-Glucosamine (ml)
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35
Thể tích nước cất (ml) 1 0,95 0,9 0,85 0,8 0,75 0,7 0,65 Tổng thể tích (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1
Phản ứng của N-acetyl-β -D-Glucosamine với thuốc thử DNS
với các nồng độ khác nhau đã chuẩn bị như trên (ml)
DNS (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Lắc đều, đun sôi 5 phút
HR2RO (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1
Lắc đều, để yên 5 phút, đo OD ở bước sóng 535 nm
Chuẩn bị dung dịch chuẩn N-acetyl-β-D-Glucosamine (10µmol/ml): cân chính xác 0,1105g N- acetyl- β -D-Glucosamine, cho nước cất vào đủ 50 ml.
Pha loãng dung dịch dung dịch chuẩn N-acetyl- β -D-Glucosamine (10µmol/ml) để có dãy nồng độ từ 0-4(µmol/ml)
Lấy 0,2ml dung dịch N-acetyl- β -D-Glucosamine với các nồng độ khác nhau cho tác dụng với 0,2ml DNS, đun sôi trong 5', thêm vào mỗi ống 1ml nước cất. Lắc đều, đo OD của dung dịch ở bước sóng 535nm.
Dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ N-acetyl-β-D-Glucosamine và giá trị OD.
Xác định HT enzyme chitinase
Nguyên tắc: HT enzyme chitinase được xác định dựa trên phương pháp định lượng glucosamine sinh ra trong quá trình phân giải chitin.
Tiến hành
* Đối với dịch enzyme làm thí nghiệm
- Cho vào các eppendorf hỗn hợp phản ứng gồm: 0,5ml enzyme + 0,5ml chitin huyền phù 1%. Ủ ở 40P
0
P
C trong vòng 60 phút.
Ngừng phản ứng bằng 0,5ml NaOH 1N và đun sôi cách thủy trong 5 phút Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch bên trên, bỏ cặn.
Cho vào eppendoff 0,2ml dung dịch thủy phân enzyme + 0,2ml DNS 1%, lắc đều, đun sôi cách thủy trong 5 phút, làm lạnh nhanh trong bồn làm lạnh.
Thêm 1ml nước cất, lắc đều và đo OD ở bước sóng 535nm * Đối với dịch enzyme làm đối chứng
- Cho 0,5 ml dịch enzyme vào ống nghiệm, nhỏ 0,5 ml NaOH 1N, đun sôi cách thủy trong 5 phút, sau đó cho thêm 0,5 ml dịch huyền phù chitin 1% vào, tiếp tục làm theo các bước tương tự như trên
- Lượng glucosamine sinh ra được xác định dựa theo đường chuẩnN-acetyl-β-D-Glucosamine
Đơn vị HT chitinase
Một đơn vị HT chitinase (đvht) là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1µmol N-acetyl-β-D- Glucosamine (NAG) từ phản ứng thủy phân cơ chất chitin trong thời gian 1 phút ở nhiệt độ 40P
0
P
C
HTR của chitinase: là số đơn vị HT enzyme có trong 1mg protein HT riêng được xác định theo công thức
HT chitinase U/ml CPE
Lượng protein mg/ml CPE
Trong đó: CPE là chế phẩm enzym Đơn vị HTR = U/mg-protein