Quá trình tách dòng được thực hiện bằng cách lai sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT (hình 2.2) do Phòng công nghệ tế bào thực vật - Viện công nghệ sinh học cung cấp đây là vector được cải tiến từ pUC18. Để việc lai sản phẩm PCR và vector tách dòng tạo vector tái tổ hợp có chứa đoạn promoter EuCAD có hiệu suất cao thì đoạn PCR chỉ thu 1 băng duy nhất và phải được loại bỏ các thành phần tạp chất trong sản phẩm PCR như mồi, đệm, dNTPs… bởi các muối có trong đệm PCR sẽ làm ảnh hưởng đến nồng độ đệm thích hợp cho enzyme thực hiện phản ứng lai. Các băng DNA sản phẩm phụ của PCR có thể ảnh hưởng tới việc chọn dòng sau này. Tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng bộ Kit QIAquick Extraction, sản phẩm sau khi tinh sạch được điện di trên gel 0.8%. Kết quả điện di sản phẩm PCR sau khi tinh sạch trên hình 3.4 và 3.5 cho thấy có thể tiến hành phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng tiếp theo.
Hình 3.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 sau tinh sạch
Giếng M: Thang DNA 1 kb; Giếng 1: Đoạn DNA sau tinh sạch
Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 sau tinh sạch
Giếng M: Thang DNA 1 kb; Giếng 1: Đoạn DNA sau tinh sạch
Phản ứng ghép nối là phản ứng hình thành liên kết phosphodiester giữa base Adenin ở đầu 5’ của sản phẩm PCR với base Thymine ở đầu 3’ của vector tách dòng nhờ hoạt tính nối của enzyme T4 ligase được thực hiện như mục 2.3.6.1. Kết quả ghép nối được thể hiện ở sản phẩm biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5.