2.2.8.1. Dòng hóa đoạn cDNA của gen CCR quan tâm vào vector nhân dòng pENTRTM/D-TOPO®
+ Phương pháp thiết kế mồi nhân đoạn cDNA của gen CCR quan tâm + Phương pháp PCR nhân đoạn cDNA của gen CCR
+ Thôi gel và tinh sạch sản phẩm thôi gel
+ Tạo plasmid tái tổ hợp pENTRTM/D-TOPO® có gắn đoạn cDNA của gen CCR (ký hiệu: pENTR/CCR)
Vector pENTRTM/D-TOPO là vector tiếp nhận có kích thước 2580 bp, trên vector này có hai vị trí attL1 và attL2, đoạn gen cần chuyển sẽ được gắn vào giữa hai vị trí này. Ngoài ra trên vector này còn có gen kháng kháng sinh kanamycin và vị trí gắn mồi pUC18 phục vụ cho việc chọn các dòng khuẩn lạc mang plasmid mong muốn. Đặc biệt, nhờ enzym topoisomerase I có sẵn trên vector nên việc thực hiện phản ứng gắn gen vào vector xảy ra với thời gian rất ngắn (chỉ mất 5 phút) và đạt hiệu quả rất cao lên tới 90%. Thành phần phản ứng ghép nối như sau:
Bảng 2.10. Thành phần phản ứng ghép nối STT Thành phần Thể tích 1 DNA 0,5 - 4l 2 Salt solution 1l 3 H20 khử ion 0 – 3,5l 4 Vector pENTR 1l 5 Tổng thế tích 6l
Hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Đặt phản ứng trên đá và thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5.
+ Biến nạp plasmid tái tổ hợp pENTR/CCR vào tế bào khả biến E.coli
DH5.
+ Chọn dòng bằng các phương pháp:
PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) sử dụng mồi pUC18.
Tách chiết plasmid theo bộ kit Plasmid Extraction Kit (Bioneer).
Bảng 2.11. Thành phàn phản ứng cắt plasmid pENTR/CCR
STT Thành phần Thể tích
1 Đệm 10X 2l
2 Enzyme giới hạn NotI 0,4l
3 Enzyme giới hạn XhoI 0,8l
4 Plasmid 3,5l
5 H20 deion 3,3l
6 Tổng thể tích 10l
2.2.8.2. Tạo vector chuyển gen mang đoạn cDNA của gen CCR quan tâm
+ Phản ứng LR tái tổ hợp giữa plasmid pENTR/CCR và vector chuyển gen pBENDER theo kĩ thuật Gateway® để tạo plasmid tái tổ hợp pBENDER mang đoạn cDNA của gen CCR (ký hiệu là pBENDER/CCR). Phản ứng được xúc tác bởi hỗn hợp enzyme Gateway®
LR ClonaseTM II.
Hình 2.5. Sơ đồ vector pBENDER
Plasmid sau khi được tinh sạch theo bộ kit sẽ được bổ sung thêm các thành phần để thực hiện phản ứng LR. Thành phần và thể tích như sau:
Bảng 2.12. Thành phần phản ứng LR STT Thành phần Thể tích 1 Plasmid pENTR/CCR 0,5l 2 Vector pBENDER 0,5l 3 H2O khử ion 3l 4 Enzyme LR clonase 1l
Ủ hỗn hợp phản ứng trên ở 250C trong 90 phút. Sau đó bổ sung 1l dung dịch proteinase K để kết thúc phản ứng. Vontex nhẹ nhàng. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 370
C trong 10 phút.
+ Biến nạp plasmid pBENDER/CCR vào tế bào khả biến E.coli DH5
theo quy trình biến nạp bằng sốc nhiệt như mục 2.3.10.1, sau đó sản phẩm biến nạp được cấy trải trên môi trường LB đặc có chứa kháng sinh chọn lọc carbenicillin.
+ Chọn dòng bằng các phương pháp:
PCR dùng cặp mồi đặc hiệu CCR entr F – CCR R.
Tách chiết plasmid theo bộ kit Plasmid Extraction Kit (Bioneer)
Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn với thành phần phản ứng và thể tích như sau:
Bảng 2.13. Thành phần phản ứng cắt plasmid pBENDER/CCR
STT Thành phần Thể tích
1 Đệm 10X 2l
2 Enzyme giới hạn XhoI 0,5l
4 Plasmid 3,5l
5 H20 deion 4l
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN