2.2.3.1. Quy trình tách chiết DNA tổng số từ mô gỗ bạch đàn:
Hóa chất
Bảng 2.1: Thành phần dung dịch đệm tách chiết
STT Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng Trong 20ml
1 Tris – HCl 1 M, pH = 8,0 0,1 M 2ml 2 NaCl 5 M 1,4 M 5.6ml 3 EDTA 0,5 M 0,02 M 0.8ml 4 CTAB 2% 0.4g 5 H2O 11.2ml Quy trình:
Cân 200 mg mẫu và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng bằng cối chầy sứ cho đến khi thành dạng bột mịn.
Bổ sung thêm 700µl dung dịch đệm tách chiết DNA và trộn đều bằng cách đảo ngược nhẹ.
Ủ ở nhiệt độ 650
Thêm 600µl dung dịch Chloroform: Isoamyl (24: 1) và đảo đều, để 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p, ở 40C, Trong 5 phút. Dùng pipette hút lấy 500µl dịch sang ống Eppendorf 1,5 ml, ủ vào đá.
Thêm 500µl isopropanol lạnh, ủ hỗn hợp trong đá 15 phút. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p, ở 40C, trong 10 phút.
Loại bỏ phần dịch nổi phía trên rửa DNA kết tủa dưới đáy ống bằng cồn 70% (1 lần). Ly tâm 13000 v/p và làm khô DNA kết tủa ở đáy ống eppendorf.
Thêm 50µl nước khử ion và 2µl RNAse, ủ ở 370C trong 30 phút.
Bảo quản DNA tổng số ở -200C.
Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA
Việc xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA được thực hiện bằng cách đo độ hấp thụ tia UV ở các bước sóng 230, 260, 280 nm trên máy đo quang phổ. Khi đó DNA có đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 260 nm. Từ giá trị OD260 ta sẽ tính được hàm lượng của DNA thu được (giá trị OD = 1,0 tương ứng với hàm lượng DNA là 50 µg/l mẫu). Độ tinh sạch của DNA có thể được xác định bằng tỷ số OD260/280 và OD260/OD230. Các tỷ số này lần lượt chỉ ra sự có mặt của tạp chất là protein, các hợp chất polyphenol và cacbon hydrate. Một mẫu DNA được coi là tinh sạch nếu tỷ số OD260/280 và OD260/OD230 đạt 1,8 – 2,0.
Các bước đo được tiến hành như sau:
Chỉnh cân bằng máy: dùng nước cất 2 lần khử ion, vô trùng để làm chuẩn.
Kiểm tra máy: đo một mẫu DNA có nồng độ chuẩn đã biết trước (DNA của thực khuẩn thể λ).
DNA được pha loãng 200 lần theo công thức: lấy 995µl nước cất + 5µl DNA mẫu, lắc đều, cho vào cuvette, đặt vào máy đo.
Sau mỗi lần đo phải rửa sạch cuvette bằng nước cất.
In kết quả đo được.
Hàm lượng và độ sạch của DNA được tính theo công thức:
o Hàm lượng DNA: E = 50 x HSPL x OD260
o Độ sạch của DNA: OD260/280 và OD260/OD230
Trong đó: E: Hàm lượng DNA (ng/µ). 50: Hằng số.
HSPL: Hệ số pha loãng.
OD230: Chỉ số đo được ở bước sóng 230 nm. OD260: Chỉ số đo được ở bước sóng 260 nm. OD280: Chỉ số đo được ở bước sóng 280 nm.
2.2.3.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Hóa chất
Bảng 2.2: Thành phần dung dịch đệm tách chiết (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
STT Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng Trong 20 ml
1 Tris – HCl 1 M, pH = 8,0 0,1 M 2 ml 2 NaCl 5 M 2 M 8 ml 3 EDTA 0,5 M 0,0625 M 2.5 ml 4 CTAB 2% 0.4g 5 PVP 2% 0.4g 6 -mercaptoethanol 2% 0.4 ml 7 H20 (khử ion) Tổng 7.1 ml
Ủ ở 650C đến khi CTAB tan hoàn toàn.
Cân 200 mg mẫu và nghiền kĩ trong nitơ lỏng bằng cối chầy sứ cho đến khi thành dạng bột mịn.
Bổ sung thêm 700µl dung dịch đệm tách và trộn đều bằng cách đảo ngược nhẹ.
Ủ ở nhiệt độ 650C khoảng 10 phút
Thêm 700µl dung dịch Chloroform : Isoamyl (24 : 1) và đảo đều, để 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p, ở 40
C, trong 20 phút. Dùng pipet hút lấy 600µl dịch sang ống Eppendorf 1,5 ml, ủ vào đá.
Thêm 150µl dung dịch muối LiCl 10M để ở 40C qua đêm. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p ở 40
C, trong 10 phút.
Loại bỏ phần dịch nổi phía trên sau đó rửa kết tủa dưới đáy ống bằng cồn 70% (1 đến 2 lần). Ly tâm 13000 v/p và làm khô kết tủa ở đáy ống eppendorf.
Thêm 50 µl nước khử ion và điện di kiểm tra sản phẩm.
2.2.3.3. Phương pháp khử DNA Bảng 2.3: Thành phần phản ứng khử DNA STT Thành phần Thể tích (μl) 1 Mẫu RNA 8 μl 2 Đệm 10X 1 μl 3 DNAse 1 μl 4 Tổng 10 μl Quy trình: Ủ hỗn hợp trên ở 370 C trong 30 phút.
Ủ ở 650
C trong 10 phút.
Điện di kiểm tra sản phẩm.