Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.2. Kết quả sử dụng phƣơng pháp Real time PCR kiểm tra phát hiện và định lƣợng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dƣơng tính,
lƣợng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dƣơng tính, âm tính với WSSV
Kết quả thử nghiệm Real - time PCR trên 12 mẫu dương tính và âm tính thể hiện qua các đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang trên đồ thị ở Hình 4.2.
Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 12 mẫu tơm sú
: 8: 9 : 9 : 10 : 11 : 12 :đối chứng âm ▲: các chuẩn : 1 : 2 : 3 : 4 : 5 : 6 : 7
Hình 4.2 thể hiện rõ các đường cong biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 12 mẫu đều vượt qua đường baseline subtracted (đường đã trừ đi tín hiệu nền), điều này cho thấy các mẫu tơm đều bị nhiễm virus gây bệnh đốm trắng. Các mẫu: 1, 5, 6, 7, 8 nhiễm WSSV nặng thể hiện qua chu kỳ ngưỡng lên rất sớm từ chu kỳ 17 đến 21. Các mẫu cịn lại nhiễm WSSV nhẹ đến trung bình thể hiện qua chu kỳ ngưỡng lên khá muộn từ chu kỳ 33 đến 39.
Kết quả thử nghiệm Real – time PCR lần thứ 2 cho kết quả tương tự, cả 12 mẫu đều cho kết quả dương tính với WSSV. Kết quả này hồn tồn tương thích với kết quả kiểm tra qua Non Stop Nested PCR.
Kết quả kiểm tra được tĩm tắt qua Bảng 4.1 như sau:
Hình 4.3 Kết quả kiểm tra WSSV qua Non Stop Nested PCR của 12 mẫu tơm sú
633bp
Bảng 4.1 cho thấy kết quả kiểm tra mầm bệnh đốm trắng ở các mẫu 9, 10, 11, 12 bằng phương pháp Real - time PCR và Non Stop Nested PCR cĩ sự khác biệt với kết quả kiểm tra bằng các phương pháp PCR và Semi – Nested PCR. Hai mẫu 9, 10 đã qua kiểm tra PCR và hai mẫu 11, 12 đã qua kiểm tra Semi – Nested PCR đều cho kết quả âm tính nhưng lại cho kết quả dương tính khi tơi tiến hành kiểm tra bằng Real - time PCR và Non Stop Nested PCR với mức độ nhiễm rất nhẹ (chỉ xuất hiện một băng 221 bp ở Non Stop Nested PCR và chỉ vài bản sao ở Real - time PCR). Sai lệch này cĩ thể do độ nhạy của Real - time PCR và Non Stop Nested PCR cao hơn PCR thơng thường và Semi – Nested PCR. Vì vậy tơi tiến hành kiểm tra tiếp 3 mẫu âm tính đã được xác định bằng PCR, kết quả thu được qua Hình 4.4.
Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra WSSV trên 12 mẫu tơm sú
Mẫu
Kết quả đã qua kiểm tra PCR và Semi-Nested
PCR
Non Stop Nested PCR Real - time PCR
1 + (PCR) + + 2 + (PCR) + + 3 + (PCR) + + 4 + (PCR) + + 5 + (Semi-Nested PCR) + + 6 + (Semi-Nested PCR) + + 7 + (Semi-Nested PCR) + + 8 + (Semi-Nested PCR) + + 9 - (PCR) + + 10 - (PCR) + + 11 - (Semi-Nested PCR) + + 12 - (Semi-Nested PCR) + +
Hình 4.4 cho thấy đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của mẫu 13 nằm dưới đường baseline subtracted cho kết quả âm tính. Hai mẫu 14 và 15 cĩ tín hiệu huỳnh quang vượt qua đường baseline subtracted ở chu kỳ ngưỡng rất muộn: 41,73 và 40,64, chứng tỏ các mẫu này nhiễm WSSV ở mức độ rất nhẹ.
Kết quả kiểm tra 3 mẫu tơm sú qua Non Stop Nested PCR như sau:
Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 3 mẫu tơm sú
▲: các chuẩn
: đối chứng âm
: mẫu 13
: mẫu 14
: mẫu 15
Hình 4.5 Kết quả Non Stop Nested PCR của 3 mẫu tơm sú
MK (-) (+) 13 14 15 633 bp 633 bp
Kết quả kiểm tra 3 mẫu tơm sú được tĩm tắt ở Bảng 4.2 như sau:
Mẫu 13 được kiểm tra qua Real - time PCR cho kết quả tương thích với kết quả kiểm tra của phương pháp PCR và Non Stop Nested PCR. Hai mẫu 14 và 15 cịn lại kiểm tra qua Real - time PCR cho kết quả khác biệt so với kết quả kiểm tra của phương pháp PCR và ngay cả Non Stop Nested PCR. Như vậy, trong 7 mẫu đã xác định âm tính qua PCR và Semi – Nested PCR, phương pháp Real – time PCR cho kết quả 6 mẫu dương tính và 1 mẫu âm tính; kết quả kiểm tra qua Non Stop Nested PCR cho thấy cĩ 4 trong 7 mẫu trên là dương tính và 3 mẫu âm tính. Điều này chứng tỏ phương pháp Non Stop Nested PCR mà tơi sử dụng cĩ khả năng phát hiện những mẫu nhiễm WSSV rất nhẹ mà khơng thể phát hiện bằng phương pháp PCR và Semi – Nested PCR mà các phịng xét nghiệm khác đang sử dụng, đồng thời phương pháp Real – time PCR cĩ khả năng phát hiện các mẫu nhiễm WSSV mà các phương pháp khác khơng cĩ khả năng phát hiện. Như vậy, phương pháp Real – time PCR cĩ thể sử dụng để kiểm tra phát hiện WSSV trên tơm sú nuơi và thậm chí cho kết quả phát hiện mầm bệnh cịn tốt hơn so với các phương pháp khác.
Để định lượng số bản sao ban đầu của virus gây bệnh đốm trắng trên 12 mẫu tơm, tơi tiến hành định lượng dựa trên 5 chuẩn, kết quả thu được qua Hình 4.6.
Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn của 12 mẫu tơm sú Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra 3 mẫu tơm sú
Mẫu Kết quả đã xét nghiệm bằng
PCR
Non Stop Nested
PCR Real - time PCR
13 - - -
14 - - +
Hiệu quả của phản ứng Real - time PCR trung bình qua 2 lần lặp lại đạt khá cao 97,95%, cho thấy phản ứng Real - time PCR này hoạt động tốt. Hệ số tương quan thu được rất cao (r2 = 1) chứng tỏ mối tương quan tuyến tính giữa log số bản sao ban đầu và số chu kỳ ngưỡng rất chặt.
Số bản sao trung bình của WSSV trên 12 mẫu sau 2 lần lặp lại được tĩm tắt ở Bảng 4.3.
Bảng 4.3 cho thấy mẫu 1, 5, 6, 7, 8 nhiễm virus gây bệnh đốm trắng khá cao tương ứng với số bản sao ban đầu: 2,98.106; 2,57.105; 4,25.105; 6,95.105; 6,97.105 bản sao. Các mẫu 2, 3 nhiễm WSSV nhẹ tương ứng với số bản sao ban đầu: 2,47.101; 4,77.101 bản sao. Các mẫu 4, 9, 10, 11, 12 nhiễm virus gây bệnh đốm trắng rất nhẹ thể hiện qua số bản sao ban đầu thấp: 2; 5; 2; 6; 4 bản sao. Điều này cho thấy phương pháp Real – time PCR cĩ thể phát hiện các mẫu nhiễm WSSV với số lượng bản sao ban đầu rất thấp (2 bản sao) cho nên cĩ thể phát hiện được các mẫu nhiễm WSSV rất nhẹ mà phương pháp PCR và Semi – Nested PCR cho kết quả là âm tính.
Kết quả kiểm tra bằng Non Stop Nested PCR cũng cho kết quả là cả 12 mẫu đều dương tính với WSSV với số bản sao ban đầu rất thấp (theo kết quả định lượng của Real – time PCR) chứng tỏ rằng phương pháp Non Stop Nested PCR mà tơi sử dụng
Mẫu Chu kỳ ngưỡng trung bình Số bản sao ban đầu trung bình
1 16,67 2,98.106 2 33,82 2,47.101 3 32,84 4,77.101 4 37,69 1,74 5 20,28 2,57.105 6 19,53 4,25.105 7 18,83 6,95.105 8 18,81 6,97.105 9 36,68 4,64 10 38,20 1,23 11 35,99 5,69 12 37,79 3,45
cĩ độ nhạy rất cao (2 bản sao), cĩ thể dùng để kiểm tra virus gây bệnh đốm trắng trên tơm sú.
Số bản sao ban đầu của 3 mẫu tơm được định lượng qua Real – time PCR dựa trên đồ thị biểu diễn đường chuẩn (Hình 4.7).
Hiệu quả của phản ứng Real - time PCR trung bình qua 2 lần lặp lại đạt khá cao 99,4%, chứng tỏ phản ứng Real - time PCR hoạt động tốt. Hệ số tương quan (r2 = 1) giữa log số bản sao ban đầu và số chu kỳ rất chặt.
Kết quả sau 2 lần lặp lại được tĩm tắt ở Bảng 4.4
Hai mẫu 14 và 15 nhiễm WSSV rất nhẹ, chỉ được phát hiện qua Real – time PCR với 1 bản sao ban đầu, trong khi đĩ PCR và ngay cả Non Stop Nested PCR cũng khơng thể phát hiện được. Mẫu 13 cho kết quả âm tính với tất cả các phương pháp xét nghiệm cho thấy là mẫu khơng bị nhiễm virus gây bệnh đốm trắng.
Từ các kết quả thử nghiệm trên cho thấy phương pháp Real - time PCR cĩ khả năng phát hiện được mầm bệnh WSSV mà các phương pháp khác cĩ thể phát hiện. Ngồi ra Real - time PCR cịn cĩ khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV ngay cả ở mức độ nhiễm rất nhẹ (1 bản sao) mà các phương pháp khác khơng cĩ khả năng phát hiện.
Hình 4.7 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn của 3 mẫu tơm sú
Mẫu Chu kỳ ngưỡng trung bình Số bản sao ban đầu trung bình
13 N/A N/A
14 41,73 1,54.10-1
15 40,64 3,27.10-1
Bảng 4.4 Số bản sao ban đầu trung bình của 3 mẫu tơm sú sau hai lần lặp lại