Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.4.Kết quả khảo sát độ nhạy giữa phƣơng pháp Real time PCR và Non Stop Nested PCR
Nested PCR
Kết quả Real – time PCR của các nồng độ pha lỗng từ 10-1
đến 10-8 thể hiện qua Hình 4.12.
Bảng 4.6 Độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình ở các nồng độ pha lỗng của mẫu 7 sau 3 lần lặp lại
Nồng độ mẫu 7
Chu kỳ ngưỡng trung bình
Số bản sao ban đầu
trung bình Độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu
100 18,78 1,23.106 0,36.106
10-1 21,91 1,38.105 0,18.105
10-2 25,66 1,02.104 0,061.104
Sau hai lần chạy Real – time PCR ở các nồng độ pha lỗng 10-1
đến 10-8 của mẫu, kết quả cho thấy ở các nồng độ pha lỗng từ 10-1 đến 10-7 đều cĩ đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ nằm trên đường baseline subtracted, cho kết quả dương tính với WSSV, riêng nồng độ pha lỗng 10-8
cĩ đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ nằm dưới đường baseline subtracted, cho kết quả âm tính. Điều này chứng tỏ phương pháp Real - time PCR cĩ khả năng phát hiện tới nồng độ pha lỗng 10-7.
Các nồng độ pha lỗng của mẫu trên cĩ kết quả kiểm tra qua Non Stop Nested PCR như sau:
Hình 4.12 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của mẫu nhiễm WSSV pha lỗng từ 10-1
đến 10-8 : 10-5 : 10-6 : 10-7 : 10-8 : đối chứng âm : 10-1 : 10-2 : 10-3 : 10-4
Ở các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 đều xuất hiện hai băng đặc hiệu 633 bp và 221 bp, cho kết quả nhiễm WSSV nặng (số lượng bản sao ban đầu lớn). Ở các nồng độ càng lỗng: 10-4, 10-5, 10-6 số lượng ADN đích càng giảm nên chỉ hiện diện băng 221 bp (dương tính nhẹ với WSSV). Theo chiều giảm dần nồng độ mẫu pha lỗng, các băng xuất hiện càng mờ dần. Ở hai nồng độ 10-7
, 10-8 khơng thấy xuất hiện băng đặc hiệu (âm tính với WSSV). Kết quả kiểm tra lần 2 bằng Non Stop Nested PCR trên các mẫu pha lỗng này cũng cho kết quả tương tự. Từ các kết quả trên cho thấy Non Stop Nested PCR cĩ khả năng phát hiện mẫu tơm nhiễm WSSV cĩ nồng độ pha lỗng từ 10-1 đến 10-6, và khơng cĩ khả năng phát hiện mẫu tơm nhiễm WSSV cĩ nồng độ pha lỗng 10-7
và 10-8.
Kết quả so sánh độ nhạy giữa hai phương pháp được tĩm tắt qua Bảng 4.7.
Hình 4.13 Kết quả kiểm tra Non Stop Nested PCR ở các nồng độ pha lỗng của mẫu nhiễm WSSV (+) (-) MK 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 633bp 221bp
Với kết quả thu nhận từ khảo sát trên (thể hiện ở Bảng 4.7), tơi nhận thấy phương pháp Real - time PCR nhạy hơn phương pháp Non Stop Nested PCR 10 lần. Nếu cĩ điều kiện nên tiến hành pha lỗng mẫu từ nồng độ pha lỗng 10-6 (nồng độ pha lỗng cuối cùng mà hai phương pháp cĩ thể phát hiện mẫu dương tính với WSSV) để so sánh độ nhạy của hai phương pháp một cách chính xác hơn.