VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2.Trang thiết bị, dụng cụ và hố chất 1 Trang thiết bị và dụng cụ
3.3.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ
-Hệ thống Real - time PCR của Bio - Rad (Hình 2.8) -Tủ cấy vơ trùng
-Tủ lạnh lưu mẫu -Máy khuấy từ
-Máy nhiệt khơ (hoặc bể điều nhiệt) -Máy ly tâm
-Vortex mixer (máy trộn mẫu)
-Các loại eppendorf 0,2; 0,5; 1,5 ml
-Micropipette với các loại thể tích từ 0,5 µl đến 1000 µl -Cân phân tích
-Bếp điện
-Kéo, đèn cồn và panh
-Bộ điện di nằm ngang và bộ nguồn
-Máy đọc kết quả điện di GelDoc iQ của Bio - Rad -Máy iCycler của Bio - Rad
Hình 3.3 Máy iCycler
3.3.2.2. Hố chất
Bộ kit “Real - time PCR phát hiện WSSV trên tơm” của cơng ty Nam Khoa do Bio - Rad tài trợ.
Các thành phần của bộ kit gồm cĩ:
- Bộ thuốc thử ly trích thơ ADN ở tơm gồm cĩ các thành phần để pha dung dịch tách chiết: nước cất (50 ml), NaOH (350 µl), SDS (150 µl), ống eppendorf 1,5 ml: 50 ống, chày nhựa (dụng cụ nghiền mẫu dùng cho ống eppendorf): 10 cái/ gĩi x 5 gĩi
- 50 ống eppendorf, mỗi ống cĩ chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Real - time PCR gồm các thành phần: primer, dNTP, Taq polymerase, TaqMan probe, Mg2+, dung dịch đệm PCR.
- Đối chứng âm (control (-)): 100 µl dung dịch TE 1X - Đối chứng dương (control (+)): 100 µl ADN của WSSV
- 5 chuẩn (standard (std)): 50 µl mỗi chuẩn cĩ chứa ADN của WSSV với hàm lượng lần lượt là: 105 bản sao/ 2 µl, 104
bản sao/ 2 µl, 103 bản sao/ 2 µl, 102 bản sao/ 2 µl, 101 bản sao/ 2 µl.
Bộ kit “Nested PCR phát hiện WSSV trên tơm” gồm cĩ:
- Bộ thuốc thử ly trích thơ ADN ở tơm với các thành phần tương tự như bộ thuốc thử ly trích thơ ADN ở tơm đi kèm trong bộ kit “Real - time PCR phát hiện WSSV trên tơm”
- 50 ống eppendorf, mỗi ống cĩ chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Non Stop Nested PCR gồm các thành phần: dung dịch đệm PCR, Taq polymerase, dNTP, primer, Mg2+, UNG và dUTP.
- Đối chứng âm (control (-)): 100 µl dung dịch TE 1X - Đối chứng dương (control (+)): 100 µl ADN của WSSV
- Hĩa chất dùng cho điện di: bộ thuốc thử điện di do cơng ty Nam Khoa sản xuất từ các hố chất của Bio - Rad, Merck và Sigma gồm cĩ dung dịch TBE 10X (Tris - Boric acid - EDTA), agarose, dung dịch nạp mẫu 5X (bromophenol blue và glycerol), dung dịch ethidium bromide (10 mg/ ml), thang ADN chuẩn 100 – 1000 bp cĩ khoảng cách 100 bp của Bio - Rad.
Bộ ly trích Instagene Matrix của cơng ty Bio – Rad: gồm cĩ 20 ml dung dịch Instagene Matrix cĩ các hạt nhỏ lơ lửng tích điện âm và các protein kinase. Các hạt nhỏ này sẽ gắn kết với ion hĩa trị hai (các ion này hỗ trợ enzyme phân giải ADN mẫu) trong dịch tách chiết ADN, nhờ đĩ các ion hĩa trị hai được loại bỏ. Các protein kinase cĩ tác dụng biến tính các thành phần protein trong phần dịch nổi sau khi ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt.